子宮內膜異位症之分子機轉及在不孕症治療之臨床應用-子宮內膜異位症之轉譯基因體學研究

子計畫一: 子宮內膜異位症之轉譯基因體學研究 計畫主持人：曾啟瑞 子宮內膜異位症（endometriosis）是由於婦女子宮內膜組織因不明原因附著於不適當 的位置，導致胚胎著床不易，增加流產的機率，造成不孕。在子宮內膜異位症的病生理 顯示，這些不正常的異位組織具有類似癌細胞般的不正常增生侵襲和附著，有許多因子 包括免疫異常、基因遺傳、和環境因子都被認為與子宮內膜異位症的成因有關; 然而， 子宮內膜異位症的成因與機轉迄今仍未明瞭。在台北醫學大學附設醫院的生殖醫學中心 平均每年皆有1600 餘位婦女接受人工授孕或試管嬰兒的治療。其中，平均每四位即有一 位患有子宮內膜異位症。因為子宮內膜異位症的成因與機轉迄今仍未明瞭；且目前臨床 上在子宮內膜異位症的診斷與治療都有許多問題: 包括仍需依賴具侵犯性的腹腔鏡檢察 以確診子宮內膜異位症，而子宮內膜異位症的治療仍主要以手術去除異位的內膜組織或 者以荷爾蒙藥物治療, 但兩種方式有再度復發、沾粘及藥物所引起的副作用等缺點。過去 我們在基因微陣列(cDNA microarray)的研究經驗指出有一系列包括：integrins/ cell adhesion molecules、metalloproteinases、cathepsins、estrogen receptors、VEGFs、aromatase、 EGFR、MAPK 和cytokines (IL-6, SDF-1, CXCR4)的基因表現與子宮內膜異位症息息相 關，因此，本計劃我們將配合功能性基因體學的探討，研究參與子宮內膜異位症的基因 與表現頻譜、機轉與訊息傳遞路徑、和具影響子宮內膜細胞生長與侵襲功能相關基因； 此外，我們將更進一步以新世代的基因定序系統(next-generation sequencer, SOLiD 3plus, ABI)分析有家族史子宮內膜異位症病人的全基因體自動化定序。本計畫將透過下列幾個 主要目標(specific aims) 進行此轉譯基因體學研究的成果整合，將可以為子宮內膜異位症 提供臨床之診斷與治療的解決之道。(一) 解析子宮內膜異位症相關的基因與表現頻譜、 機轉與訊息傳遞路徑、和具影響子宮內膜細胞生長與侵襲功能相關基因。(二) 以高通量 定序分析平台進行有家族史子宮內膜異位症病人的全基因自動定序分析，期望找尋與子 宮內膜異位症相關的基因變異。(三) 這些資訊除了將可提供本中心其它子計劃進行相關 微小核糖核酸(microRNA)和蛋白質體學(protenomics)的資訊整合研究之外，所得到的成果 可以增加我們對於子宮內膜異位症病理機轉的認識；也將配合臨床檢體進行診斷與評估 預後的生物標誌(Bio-markers)相關研究。(四) 透過研究這些與影響子宮內膜細胞生長與 侵襲功能的基因或訊息傳遞路徑，我們將以這些因子當做標靶(Targets)，以目標已經建立 的herbal drug bank (約有600 個compounds)，進行篩選具有潛力的先導藥物(leading compounds)，並配合其他子計劃進行動物模式實驗。本計劃將對子宮內膜異位症的病理 機轉的瞭解，與解決診斷和治療提供新的策略。 子計畫二：微小核醣核酸在子宮內膜異位症扮演角色與調控機轉 計畫主持人：沈杏娟 子宮內膜異位症為一常見的婦科疾病，其病理機轉被提出可能與荷爾蒙、自體免疫 和基因方面的異常有關，但確實的原因至今仍然不十分清楚。近幾年的研究證據顯示微 小核醣核酸(microRNA)可能與子宮內膜異位症有密切的關聯性。microRNA 是小片段的 單股核醣核酸，它會透過干擾轉譯作用的進行得以調控基因的表現。目前以知microRNA 除了可以調控細胞正常的表現外，也可能與包括癌症、心血管疾病甚至子宮內膜異位症 等疾病的發生有關。生物晶片與生物資訊分析的研究顯示，子宮內膜異位症組織與正常 的子宮內膜組織內microRNA 的表現量明顯不同。在正常和異位組織中microRNA 表現 情況是如此不同，透露出microRNA 極可能參與在子宮內膜異位症的致病過程中。很不 幸的，目前已知關於microRNA 和子宮內膜異位症的研究結果，絕大多數來自於生物晶 片與生物資訊運算分析而得，只有非常少數的結果透過生物實驗獲得驗證，因此，關於 子宮內膜異位症與microRNA 的真正關係，目前仍充滿許多的不確定性。從這樣的研究 數據中，判讀出哪些microRNA/標的基因與疾病的密切相關性，確實有很大的困難。基於 前述理由，我們希望能建立一套更有效率的分析平台來驗證microRNA/標的基因與疾病的 關聯性。本子計畫將整合已知的生物資訊資料庫，並結合實驗室先前建立的分析模式， 利用特殊運算方法更精準的確認與子宮內膜異位密切相關的microRNA/其標的基因並進 行後續的生物研究。 本研究計畫預定完成的目標： （1）建立高效率且更精準的分析平台篩選microRNA 與其標的基因。 （2）確認宿主基因、microRNA 以及下游標的基因的配對關係。 （3）鑑定與子宮內膜異位症相關的microRNA 與其標的基因。 （4）評估臨床病人檢體miRNA 表現情形。 子計畫三：發炎細胞激素與子宮內膜幹細胞於子宮內膜異位症的角色與臨床意義 計畫主持人：黃彥華 人類子宮內膜是一個具有重組能力的動態組織，它經內膜基層幹細胞的調控機制， 在婦女生育期時會週期性地進行再生(proliferation)、分化(differentiation)與脫落的過程， 以利受精卵成功著床。子宮內膜異位症(endometriosis) 顧名思義是子宮內膜(包括子宮腺 體或間葉細胞)生長在子宮腔以外的位置；臨床診斷得知，不孕症的婦女中有高達30-40 % 患有子宮內膜異位症，是造成婦女不孕最普遍的疾病。子宮內膜若發生在卵巢，則稱為 巧克力囊腫(chocolate cyst)；若侵入至子宮肌層，命名為子宮肌瘤(adenomyosis)；其他發 生於腹腔者，則統稱之為子宮內膜異位症。子宮內膜異位症成因相當複雜，其致病機制 至今仍是未知。我們實驗室經分析大量人類子宮內膜異位組織後，發現內膜異位組織高 度表現幹細胞多功能性轉錄因子Nanog 與Oct-4，顯示幹細胞與子宮內膜異位的形成的相 關性；又由於子宮內膜異位症常伴隨著子宮腔發炎反應與內膜細胞的大量增生分化與沾 黏，更強烈暗示著發炎細胞激素(inflammatory cytokine)、子宮內膜幹細胞、與子宮內膜 異位症之間的關係。這項假說也在小鼠動物模式得到初步的支持: 我們經real-time QPCR 檢測發現，小鼠子宮內膜幹細胞在發炎培養液中則表現較高程度的多功能性幹細胞基 因，例如Oct-4, Sox2, c-Myc, Klf-4 與IGF-1(請參考初步成果)。 目前相關於幹細胞如何轉形為類癌細胞(cancer-like)的機制了解還非常有限，此研究 領域進展緩慢，可能與各實驗室慣用高濃度血清進行幹細胞培養有關。含血清的培養方 式雖然容易使幹細胞較快速地增生，但也因此使其失去幹細胞特性，並且明顯地阻礙了 尋找使幹細胞轉型為癌幹細胞相關的內分泌因子及其訊息傳遞調控機制。針對這個問 題，我們實驗室已經成功建立一無血清幹細胞培養系統，不但已可以在體外從新生小鼠 的睪丸細胞為養出類似生殖精母細胞(PGC, primordial germ cells)的多功能幹細胞(Huang et al, The FASEB J, 2009)，同時也可以成功地培養小鼠子宮內膜幹細胞(請參考初步成 果)。此無血清幹細胞培養系統將可提供一獨特的細胞平台，用以探討發炎細胞激素與子 宮內膜幹細胞轉形的作用機制。因此本研究計畫的主軸，主要於探討發炎細胞激素與子 宮內膜幹細胞的交互作用，與其形成子宮內膜異位症所扮演的角色與臨床意義。 本計畫將分列四項研究目標進行研究: 一、建立無血清人類子宮內膜幹細胞之培養系統 二、探討發炎反應的細胞激素(cytokines)對人類子宮內膜幹細胞進行EMT 轉化為子 宮內膜異位症的作用機轉(體外初級培養細胞模式) 三、探討發炎反應促使子宮內膜幹細胞表現胚胎幹細胞相關基因之後生調節 (epigeneticregulation) 四、建立子宮內膜異位症之動物模式進而探討人類子宮內膜異位症之細胞激素交互 作用與藥物治療 本研究計畫的研究成果，不但對基礎科學研究有重要的貢獻，同時更可以提供針對 子宮內膜異位症具潛力的分子層次標靶治療之藥物開發臨床價值。 子計畫四：細胞著附因子配體調控子宮內膜細胞異位生長的分子機制之研究 計畫主持人：高淑慧 子宮內膜異位是婦科最常見的疾病，被定義為在子宮腔以外發現類似子宮內膜組織 的良性疾病。目前仍不清楚造成此疾病的致病機轉，此病症的形成被認為與子宮內膜異 位細胞具有tumor-like 的細胞侵入性(invasion)及轉移性(metastasis)特性有關。而細胞附著 分子(cell adhesion molecules, CAM)在細胞侵入及轉移作用中扮演重要的角色，在子宮內 膜異位患者發現可以經由特異的cell adhesion receptor 使內膜細胞沾連生長於骨盆腔。細 胞附著分子(CAM)是一種多功能的蛋白質，掌控許多調控機制如細胞的生長，增殖，分 化與再生。細胞是否移行(cell migration)取決於細胞附著 (cell adhesion)與分開(detachment) 之間的平衡，這樣的機制調控細胞的轉移及入侵。其中以αvβ3 integrin 及CD44 細胞附著 分子被發現與子宮內膜異位症息息相關。骨橋蛋白(osteopontin, OPN)是αvβ3 integrin 及 CD44 的共通配體(ligand)，被發現在人類異位子宮內膜中大量表現。在許多類型的癌細 胞中OPN 被證實可透過αvβ3 integrin 或與CD44 的結合促進細胞粘附、移行、分化、生 存、免疫功能及細胞外基質入侵的作用，並與血管新生有關。初步的研究結果發現相較 於正位內膜，在異位內膜中發現有不同的CAM 和 ECM 相關基因表達，其中OPN 的表 達最為顯著增加。 此外我們進行細胞形態、增生、移行和入侵的分析。利用免疫螢光染 色，我們發現擁有OPN 轉染的細胞其細胞突處(lamepodia)以及肌動蛋白應力纖維(stress fiber)的形成增加。在子宮內膜異位細胞表現較高的mesenchymal markers (N-cadherin)而 減少表現上皮細胞標記蛋白E-cadherin ， 進而產生上皮細胞轉形成間葉細胞 (epithelial-mesenchymal transition，EMT) 轉化作用。此外，我們也發現類固醇可增加 OPN 表達和分泌並且誘導細胞移行。因此我們推測CAM 及ECM ligand 可以調控子宮內膜細 胞異位的生長促進細胞的轉移及入侵，並產生上皮細胞的上皮-間質轉化作用。本研究主 要尋找特異性CAM 及ECM 並探討其在子宮內膜異位中所扮演的角色與功能。我們擬分 三年進行實驗分析，第一年實驗擬尋找子宮內膜異位症特異性CAM/ECM 並且探討調控 子宮內膜細胞移行和入侵的分子訊息傳遞路徑。第二年實驗擬探討OPN-αvβ3 integrin complex 或OPN-CD44 complex 及特異性CAM/ECM 是否參與子宮內膜上皮細胞轉形成間 葉細胞(epithelial-mesenchymal transition)。第三年實驗: 擬探討調節OPN 及特異性 CAM/ECM 表達的分子機轉。並且探究CAM-ECM complex 是否經由microRNA 及 inflammatory cytokine 的刺激而增加表現，進而促進內膜細胞的移行、入侵和增生的現 象。本子計畫研究希望藉由釐清CAM-ECM 引發的細胞移行及生長的分子調控機轉，尋 找可以抑制CAM-ECM 作用的專一抑制劑，也許未來可利用作為治療方針或是篩檢的指 標。 子計畫五：台灣婦女子宮內膜異位症環境與基因危險因子之流行病學研究 計畫主持人：葉錦瑩 人類生育力低下，成為一項逐漸嚴峻的醫療與公共衛生議題。生育力低下的求診個 案數逐年增加，影響人類生育力的危險因子與環境因素逐漸在惡化中。為了進一步整合 目前生殖醫學中心既有的研究與醫療資源，成立單一且有效管理的檢體庫，可方便許多 研究的進行，也能集中資源進行大型的分析研究。本研究擬收集不孕門診病患做為研究 對象，於門診及病歷的資料中，進行與檢體庫的整合分析，可以發展出國內首次的生育 力基礎資料，包括與生育力有關的疾病率、相關的危險因子以及基礎的基因資料，進一 步與國際間的疾病發生率，治療成功率做比較。子宮內膜異位症對生育力有很大的影響， 子宮內膜異位症的發病原因，目前也仍未有一個定論，目前認為有可能影響子宮內膜異 位的因子，包括：環境荷爾蒙的暴露、氧化壓力惡化的影響、或者來自遺傳及基因的因 素。藉由取得的血液檢體，我們預計利用微量金屬分析(ICP-MS)，測定包括Pb、Cd、Hg、 Cr、Mn、Se、Cu、Zn、Fe 等作為環境接觸與人體代謝的指標。此外，也將進行包括MDA、 GSH 及SOD 等血液中生物標記的測定，比較與子宮內膜異位症的相關性。將針對GST M1、GSTT1 以及GSTP1 等基因進行多型性分析。另外，對於仍有爭議的相關基因，也 會進一步比較其多型性，包括與黃體素接受器變異有關的基因PROGINS，與發炎反應有 關的基因，例如interleukin-6 等，還有與血糖、血管與組織再造相關的基因，例如MMP、 STAT、GALT 等基因。 本研究以某醫學大學所屬各教學醫院之不孕症門診病患中經內視鏡檢查確定診斷為 子宮內膜異位症者為病例組，而對照組則選自不孕症病人中未罹患子宮內膜異位症者， 利用問卷方式獲得相關資料，例如居住環境、飲食習慣、工作史、疾病史、暴露史以及 婦科狀況等，第一年將完成收集個案檢體、測定相關指標值及問卷訪視工作，並完成檢 體微量金屬元素及部分環境污染物的測定。第二年將進行DNA中相關基因之基因型作鑑 定，第三年則測定樣本的戴奧辛含量，並開發高效率檢測系統測定每一個案血液中戴奧 辛含量，同時測定檢體中壬基苯酚含量。並完成資料分析，調整其干擾因子以釐清危險 因子對疾病之影響。總之，本計畫中，我們藉由流行病學研究，找出相關之基因和環境 因素的特徵，探討主要的危險因子及生物標記，希望進一步探索其致病機轉，並提供為 台灣婦女子宮內膜異位症預防、診斷及治療之參考。 子計畫六：建構生殖醫學研究生物組織庫及篩選子宮內膜異位症生物分子標記 計畫主持人：楊維中 本計畫主持人近年來與本計畫總主持人曾啟瑞教授已利用蛋白質體學技術找到與子 宮內膜異位症(endometriosis)高度相關之血清蛋白標記(serum marker)， alpha 1-antitrypsin (α1-抗胰蛋白酵素，A1AT)及其片段已分別於2008 及 2009年獲得美國及中華民國專利。 此外，前述專利之發明人於2009年榮獲2009國家發明獎金牌獎。本計劃主持人楊維中副 教授亦榮獲2009 年Crazy Idea 應用王-生物技術研發成果創意應用競賽佳作獎。然而多年 的研究經驗得知尋找與疾病相關生物標記為目前基因體學(genomics)、蛋白質體學 (proteomics)等各種 ”體學(-omics)” 相關研究與有效生物標記之探詢及確立，須要有完整 之基因體及蛋白質體表現資料，以及完備及品質良好之生物組織，同時臨床資料的完整， 將有助於基礎研究成果之判讀及解釋。此外，若能結合生物資訊學之生物分子訊號傳遞 資料探勘系統，將有助於新藥之開發，以及找到最佳之治療及預後策略。然而，生物樣 本數目不足，生物樣本收集與前處理無法標準化，病人臨床資料不完整，以及病人治療 後之追蹤及檢體管理不完善，常成為轉譯醫學研究未竟全功之主因。為提升北醫轉譯醫 學研究之能量，台北醫學大學轉譯醫學中心(TMU-CTM)於2009年成立，以建構一校三院 臨床資料整合資訊基礎建設平台為首要目標。並計畫擬與TMU-CTM合作設立生殖醫學生 物組織庫(Biorepository of reproductive medicine)，同時將協助生殖醫學研究團隊完成生物 檢體之基因體及蛋白質體表現資料整合，以加速篩檢有效與子宮內膜異位症病程發展相 關的生物指標。此外亦可結合作為子宮內膜異位症新藥篩選之資料分析及管理平台，有 助於藥效的評估及預後，以達早期診斷，早期及有效治療之目的。