利用三段式螢光共振能量轉移觀察基因藥物與聚合微膠體在不同角膜分佈穿透(3/3)

了解有關基因/或藥物在聚合微膠體內部之體外、體內安定性、以及在 細胞與組織分佈情形，應是發展有效奈米聚合微膠體載體之重要課題。利 用距離需在10 奈米範圍中的螢光捐贈體與受體的動態排列下，螢光共振 能量轉移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)可以直接、及時微觀 察傳遞蛋白在細胞內分部與影響。在初步預試驗中，利用二個螢光分子與 聚合微膠形成複合體下，可以發現唯有這二種螢光物質在聚合微膠複合體 內，螢光捐贈體確實可以進行能量轉移至受體上；同時，利用眼角膜體外 給予螢光分子與聚合微膠複合體穿透時，螢光能量轉移可以被觀察150 分 鐘後，能隨著時間的增加進行能量轉移。因此，本計畫主要是利用三段式 螢光共振能量轉移(FRET)設計，分析觀察在不同眼角膜組織層中、基因藥 物在聚合微膠體內部三者彼此之間相關距離與排列。利用先前實驗室投於 具有專一性角膜上皮(epithelial)或間質(storma)細胞之綠色螢光蛋白質體 (pK12-eGFP or pKera3.2-eGFP)後，希望能觀察在二次螢光共振能量轉移 (GFP-基因, 基因-聚合微膠體)下，可以評估在組織、基因、聚合微膠體三 者彼此間的距離分佈。在選擇適當螢光標定rhodamine 於專一上皮或間質 細胞之基因質體(rhodamine-基因)上，同時與螢光標定DsRed2 聚合微膠體 (DsRed2-聚合微膠體)後，在二次螢光共振能量轉移[(GFP, rhodamine-基 因),(rhodamine-基因,DsRed2-聚合微膠體)]下，觀察這三者在進入角膜組 織之彼此距離與排列之分佈，以了解其穿透之特性機制。希望能找到最佳 化形成聚合複合體物化動力資訊，並且觀察在體外、體內安定性特性，並 及時完整了解帶有抗凋亡基因在聚合微膠體、細胞/組織之分佈與表現。 首先，第一年度主要目標為，配合螢光化的聚合載體 (DeRed2-PM)與基因 (rhodamine-基因)合成，觀察體外二段式之一次螢光共振能量轉移，並評估 其及時基因釋放與安定性之評估。第二年度則進行螢光化基因與聚合載體 之二段式螢光共振能量轉移進入角膜組織之及時觀察，並在添加不同穿透 抑制劑(caveolae-, clathrin-吞噬依存或能量依存)下，評估基因與聚合載體 彼此受其影響之穿透距離與排列分佈。而第三年度在具有專一角膜上皮或 間質細胞之綠色螢光蛋白體中，進行體內及時三段式之綠色螢光蛋白 /rhodamine-基因/DsRed2-聚合微膠體之二次螢光共振能量轉移觀察。利用 多功能顯像系統、及時共軛焦顯微鏡、西方轉漬法、免疫組織切片，觀察 基因與聚合微膠體在活體專一角膜組織與細胞動力學之分佈；並計算其穿 透速率以了解彼此間相關性。