探討ephrin與Netrin訊息在神經系統發育時期增效整合作用之機制

在胚胎發育時期，胞外訊息控制許多細胞行為，例如增殖、生長、及細胞互動。發育時期的細胞皆被許多訊息所影響，這些訊息必須被整合產生出且具一致性的反應。雖然有許多的訊息、與他們匹配的受體、及胞內的訊息傳遞路徑已經被發現，但他們如何協力完成相同的任務仍然是一個非常重要且未知的問題。為了深入了解這個課題，我們透過神經軸突生長錐在發育過程中，被路徑選擇點上所表達的多個分子訊號引導到正確目標的特性，去研究不同的訊息路徑是如何達成整合的效果。我們將利用運動神經細胞的生成以及與腿部肌肉的連結，去了解神經軸突如何能夠結合許多不同種類蛋白的訊息以達成一種增效的作用。這代表著不同訊號整合所得到的效果，比他們各自所產生的訊號之加總還要強。如此增效的作用有可能是透過ephrin與Netrin受體蛋白之間的互動，或與活化相同下游酵素有關。為了進一步剖析ephrin與Netrin之間的增效作用，我們提出下列假設: 在運動神經生長椎之中，造成ephrin-B2與Netrin-1 (e-N)增效作用之分子機制與影響個別配體反應的機制截然不同。我們提議以下列的研究目標與方法去證明這個假設:目標1: 探討運動神經細胞內ephrin與Netrin之間的增效作用1.1 分析由胚胎幹細胞衍生的運動神經(ES-MNs)對e-N增效作用的反應1.2 利用ES-MN去進一步探討e-N增效作用對作用時間與作用位置的差異1.3 利用生長錐崩塌分析法去評估e-N增效作用的訊息增幅效果1.4 利用基因剃除小鼠去了解e-N增效作用之中的基因互動及關聯性目標2: 探討運動神經細胞內e-N增效作用的分子機制2.1 利用生長錐崩塌分析法去了解Src的調控對e-N增效作用的影響2.2 利用生長錐崩塌分析法去了解cAMP的調控對e-N增效作用的影響2.3 測試是否受體的親和力程度在e-N增效作用過程之中會變強2.4 分析在e-N增效作用過程中，EphB訊息路徑裡重要蛋白的活化程度目標3: 探討e-N增效作用之中EphB2-Unc5c受體的互動狀況3.1 針對在e-N增效作用過程中，EphB2與Unc5c的形狀與功能之分析3.2 分析運動神經生長錐之中EphB2與Unc5的關聯性3.3 探討EphB2與Unc5的直接互動在增效作用之中所扮演的角色3.4 分析Unc5c-EphB2複合物的交互作用蛋白體