總計畫：Fibrocytes在肺纖維化角色探討-子計畫三：MicroRNAs在endothelin-1與hypoxia誘導CTGF表現之角色

肺部纖維化(Pulmonary Fibrosis)是一種嚴重且癒後差的肺部疾病，主要病理特徵是呼吸肺泡 上皮細胞之間形成纖維化細胞的集中區，纖維化區主要是由纖維母細胞(fibroblasts)與分化後 的肌纖維母細胞(myofibroblasts)所組成。最近研究指出來自骨髓之mesenchymal progenitor cells— fibrocyte有能力分化為fibroblasts與myofibroblasts，推測fibrocyte在肺纖維化形成過 程中扮演重要之角色。CTGF (Connective Tissue Growth Factor)為 CCN (Cry61/CEF-10, CTGF/Fisp-12, Nov)蛋白家族成員，我們與其他研究團隊發現CTGF大量表現與肺纖維化形 成有關，在hypoxia與Endothelin-1 (ET-1)處理下會造成肺fibroblasts大量表現CTGF。 MicroRNAs (miRNAs)為一群小分子RNA，其作用機轉為結合到Target genes之3，-UTR進而 造成mRNA降解，miRNAs不正常表現已被證實與人類疾病發生有密切關係，在Cardiac fibrosis，miRNA-133與miRNA-30表現下降來刺激CTGF基因表現;在腫瘤與chondrocyte 中miRNA-17-92與miRNA-18a和CTGF表現有關，然而在肺纖維化過程中miRNAs如何調 控CTGF表現目前仍不清楚。在Bleomycin誘導肺纖維化的動物模式發現miRNA-155表現 增加，但是 TGF-P處理會抑制 miRNA-155 表現，我們經由 miRNA target databases (TargetScan, MicroCosm Target, mirbase)分析顯示miRNA-155與CTGF 3，-UTR有結合能力。本計劃擬以 體外與體内實驗探討miRNAs在ET-1與hypoxia誘導CTGF表現與肺纖維化形成之角色。 Specific Aim 1 (1st and2nd year):探討 miRNA-155 與其他已知具調控 CTGF 之 miRNAs 如 miRNA-133、30、18a、17-92 在 ET-1 與 hypoxia 誘導 CTGF 表現之角色 Hypothesis 1: miRNAs 參與 ET-1 與 hypoxia 誘導 CTGF 表現 1.1. 偵測 miRNA-155 表現在 ET-1 與 hypoxia 處理之epithelial cells、fibroblast、fibrocytes. 1.2. 探討miR-155在ET-1 and hypoxia誘導CTGF表現之角色 1.3. 研究在ET-1與hypoxia處理下miR-155調控CTGF表現之分子機轉. 1.4. 探討已知在其他組織具調控CTGF表現之miRNAs如miRNA-155、133、30、18a、 17-92在ET-1與hypoxia誘導CTGF之角色. 1.5. 探討ET-1與hypoxia誘導訊息路徑調控miRNAs表現之角色 1.6. 分析在 normal、mild 與 chronic asthma patients 血液中 fibrocytes 其 miRNA-155、 133、30、18a、17-92 之表現（Collaboration with sub-project 1) Specific Aim 2 (1st and 2nd year):研究新 CTGF-related miRNAs 參與在 ET-1 與 hypoxia 誘 導CTGF產生. Hypothesis 2:在 ET-1 與 hypoxia 處理下 new CTGF-related miRNAs 來調控 CTGF 表現 2.1.以 miRNA microarray analysis 分析 Control 與 ET-1 or hypoxia 處理細胞後探討細胞内 miRNAs表現profiling之差異 2.2.以 quantitative RT-PCR 分析 CTGF-related miRNAs 表現情形. 2.3.以 miRNA target databases (TargetScan, MicroCosm Target, mirbase)分析所得到 CTGF-related miRNAs 與 CTGF 3，-UTR 結合情形 2.4.探討ET-1與hypoxia誘導CTGF-related miRNAs表現之分子機轉 2.5.偵測 CTGF-related miRNAs 表現 profile 在 fibrocytes 來自 normal、mild 與 chronic asthma patients (Collaboration with sub-project 1) Specific Aim 3 (3rd year):證實miRNAs在bleomycin誘導老鼠肺纖維化模式中之角色 Hypothesis 3: miRNAs差異表現參與Bleomycin誘導老鼠肺纖維化之形成 3.1.偵測ET-1 與CTGF 在Bleomycin處理Bleomycin-sensitive C57BL/6 與-resistant BALB/c mice 血液表現情形 3.2.以 miRNA microarray analysis 分析 CTGF-related miRNAs 表現 profile 在來自 Bleomycin 刺激之 C57BL/6 與 BALB/c mice 肺組織與 fibrocytes 3.3.探討Bleomycin誘導CTGF-related miRNAs表現之分子機轉 3.4.合成in vivo用之miRNAs knockdown probes來偵測in vivo miRNAs在肺纖維化之角色