細胞質表達之 AP endonuclease 1/redox factor-1 在肺腫轉移、化療藥 物之抗藥性和患者預後之角色

AP endonuclease 1 (APE1) 是base excision repair (BER) 基因，它又具有redox activity 能活化多種轉錄因子與DNA 之結合力。本研究室初步結果發現，細胞質表現之APE1 (cytoplasmic APE1) 的肺癌患者預後，較APE1 表現於細胞核(nuclear APE1) 者差，尤 其是人類乳突病毒(human papillomavirus, HPV) HPV16/18 E6-positive 之患者。在肺癌 細胞實驗則觀察到cytoplasmic APE1 表現較高之肺癌細胞的COX-2 表現較 cytoplasmic APE1 表現較低者高。已知NF-kB 活化是引起發炎反應的主要路徑，長期 慢性發炎是引起肺癌之重要機制。本計畫擬探討cytoplasmic APE1 是否會經由活化 NF-kB 而促進肺腫瘤惡化？已知APE1 主要表現於細胞核，有研究顯示APE1 蛋白經 過acetylation, phosphorylation 或nitrosation 之轉譯後修飾(posttranslational modification) 可能造成APE1 在nucleus/ cytoplasm trafficking。因此第一年將探討何種轉譯後修飾作 用是引起APE1 nuclear export 的主要機制？本研究將以coimmunoprecipitation (IP), immunofluroresent staining (IF), western blot, 以及acetylation 、PKC inhibitor 、 NO-donor 、NO scavenger 等分別處理細胞，以初步找出APE1 nuclear export 之主要 轉譯後修飾？進一步將APE1 已知或可能會發生acetylation, phosphorylation 或 nitrosation 之氨基酸位置做定點突變，以了解該轉譯後修飾作用是否確實會造成APE1 nuclear export？另外將以EMSA 和IP, western blot 等分析APE1 nulear export 造成 cytoplasmic APE1 表現增高，是否會促進COX-2 之表現？本計畫第二年將探討 cytoplasmic APE1 活化NF-kB 是否是促進肺腫瘤惡化之主要機轉？ 本研究將在 APE1 silencing 之肺癌細胞轉染全長APE1 (FL) 以及不同nuclear translocation sequence (NLS) 缺失之constructs (ND7, ND20, ND30, ND41)，而這些APE1 constructs 可以逃避 APE1 silencing 之small hairpin RNA (shRNA) 之干擾。培養出轉染這些constructs 之 stable clones，以了解NLS 缺失之細胞是否如預期會大多表現於細胞質，而轉染FL 者 則僅會表現於細胞核中？ APE1 表現於細胞質之NLS 缺失細胞，是否會活化NF-kB 而促進COX-2 之表現？並以EMSA, IP, IF, redox reaction assay 等了解cytoplasmic APE1 redox activity 是否會還原IKK 而增加與IkBα, IkBβ之交互作用，促進IkBα, IkBβ 之磷酸化與降解。並以定點突變將可能還原之cystine 位置，以確定以上之可能性。本 研究將分析細胞質表現APE1 之NLS 缺失細胞的cell proliferation, colony formation efficiency, migration/ invasion ability 和archorage-independent growth 是否確實高於FL 細胞？並注射cytoplasmic APE1 表現之NLS 缺失細胞於NOD-SCID mice 之肺臟， 以了解這些APE1 高表現之細胞是否會促進肺腫瘤之形成和轉移？第三年計畫將在細 胞以及動物模式中了解給予APE1 redox inhibitor 或NF-kB inhibitor 是否能有抑制肺 癌細胞之致癌潛力？以及動物體內之腫瘤形成與轉移？若所有之細胞與動物實驗都能 證實cytoplamic APE1 會經由活化NF-kB 而促進肺腫瘤生長與轉移，本研究將在外科 手術之肺癌患者中了解cytoplasmic APE1 之外科手術後肺癌患者之腫瘤再形成(tumor recurrence) 和遠端轉移(distant metastasis)之relative ratio (RR) 是否較nuclear APE1 患 者為高？這些患者之預後是否較差？NF-kB 調控之COX-2 的表現與cytoplasmic APE1 是否具有正相關性？細胞質表現之APE1 是否可做為獨立之臨床預後指標 (independent prognostic indicator)？並了解cytoplasmic APE1 表現之NLS 缺失的細 胞，是否有較高之cisplatin 抗藥性，而使得患者有較差之預後？並確定multiple drug resistance (MDR)是否是造成cisplatin 抗藥性產生的主要基因？ 若給予APE1 redox inhibitor 或NF-kB inhibitor 是否能提高cisplatin 之drug sensivity？總之本計畫將由細 胞模式、動物模式和肺癌檢體一系列之基礎與臨床之研究結果，以建立個人化醫療 (tailor medicine) 的一個例子，期望能有效治療細胞質表現APE1 之肺癌患者，以提高 肺癌患者之存活率，尤其是HPV 引起之肺癌患者。