Aldose reductase (AR)調控膠原蛋白GPVI及凝血酉每PAR4所引起血小板活化及細胞凋亡的新角色: Arf-AR在無核細胞中所扮演的訊息傳遞機制

Aldose reductase (AR)是一種 NADPH-依賴型的酵素，它可將 glucose還原成 sorbitol,同時伴隨 著氧化壓力的增加。Sorbitol 因無法穿過細胞膜，因此會堆積在細胞內而導致離子的不平衡及蛋 白質溶解度下降，許多研究已證實糖尿病所引起的一些併發症可能與此反應有關。最近更有研究 指出，在正常的血糖濃度下，AR 也參與細胞增生及細胞凋亡反應，同時它亦與動脈血栓的形成 有關。血小板為無核細胞，其生理功能為參與體內凝血反應或者誘發病理性的動脈血栓。Collagen 及 thrombin 都是重要的血小板活化劑，collagen 會結合到其受體如 glycoprotein (GP)VI及 integrin 21, thrombin 也會結合到其受體 protease-activated receptors (PARs; 如 PAR1 及 PAR4)，這些結合 會分別引起不同的訊息傳遞作用而刺激血小板活化。再者像 Ras superfamily的這些小分子 GTPase 如 ADP-ribosylation factors (Arfs)亦與血小板活化有關，其中 Arf6為 Arf家族成員中唯一只結合到 細胞膜的 GTPase，目前 Arf6 被認為可能參與初期的血小板活化反應。另外，因血小板是由 megakaryocyte 所分裂而來，因此 megakaryocyte 可能會賦予血小板一定量且具蛋白轉譯能力的 mRNA。在未活化的狀態下，血小板既存的 mRNA具有限度的蛋白轉譯能力，一旦它被活化則其 蛋白轉譯能力亦隨之增加。最近有研究指出血小板具有功能性的 spliceosomal components,其功能 應該與將 pre-mRNA splicing成 mRNA有關，至於其轉譯機制目前仍不明。一般細胞凋亡反應約 可分為 caspase-dependent 及-independent 二個路徑；caspase-dependent 路徑主要經由外部的 death receptor (DR)被活化或經由粒線體的反應，而 caspase-independent 路徑主要與 apoptogenic factors 對細胞核的作用有關。目前已知血小板亦會表現一些與細胞凋亡有關的蛋白如 caspases 等，但這 些蛋白如何在無核細胞中進行細胞凋亡反應及其與臨床疾病間的相關聯性等目前研究亦不多。本 實驗室初步研究發現，投與 AR 的專一性抑制劑 epalrestat 可明顯的抑制由 collagen 及 convulxin (GPVI的活化劑)所引起的血小板凝集反應，但對 aggretin (integrin 21活化劑)則無抑制作用；同 樣的 epalrestat 可明顯的抑制由 thrombin 及 PAR4-AP 所引起的血小板凝集反應，但對 PAR1-AP 則無抑制作用(Fig.1)，此結果顯示 AR 可能參與 collagen 受體 GPVI及 thrombin 受體 PAR4所引起 的血小板活化。再者，convulxin及 PAR4-AP可增加AR蛋白的表現(Fig.2A)且此反應可被 epalrestat (Fig.2B), cycloheximide (Fig.3B)或者轉染之 AR siRNA (Fig.3C)所抑制。在 RT-PCR 及新世代定序 (NGS)實驗中也證實血小板的確有 AR mRNA的存在(Figs.3A,4)。另外，利用 LC-MS/MS (Fig.5A) 及飛行時間式二次離子質譜儀(TOP-SIMS)分析(Figs.5B,C)，結果顯示 convulxin的確可刺激 sorbitol 的增加(未活化, 2.6 ± 0.2 vs.活化, 3.3 ± 0.1 g/ml; n=3)。由上述結果顯示，GPVI及 PAR4 的確可調 控 AR 的活性及其蛋白表現，且此蛋白表現應該會被 mRNA所調控。另外，我們亦發現 convulxin 會活化 Arf6，但此反應無法被 epalrestat 所抑制(Fig.6), 推測 Arf6 可能是 AR 的上游調控者，但 Arf6-AR 之間如何運作亦或兩者間需經由第三者來傳遞訊息，值得進一步闡明。Convulxin也會刺 激 caspase 3的活化，且此反應可被 epalrestat 所抑制(Fig.6), 此暗示著 AR 可能亦參與血小板細胞 凋亡反應。綜合以上結果顯示 AR 不論在血小板活化或細胞凋亡過程中的確扮演重要角色，但對 於其詳細作用機轉特別是在無核細胞中其 mRNA 如何透過轉譯機制(translational machinery)增加 AR 蛋白的表現目前仍不清楚也是值得研究的課題。因此本計畫將深入且有系統性的研究 AR 對 血小板的影響(Fig.7)。 目標 1: 在正常血糖濃度下，比較 AR 對 GPVI及 PAR4 所調控的血小板訊息傳遞作用的差異性。 目標 2: 研究及比較 AR 與上游調控者(如 Arf family 或一些未知蛋白)分別與 GPVI及 PAR4 間的 相互作用關係。 目標 3: 探討 GPVI及 PAR4 分別被刺激下，mRNA是透過何種轉譯機制來調控 AR 蛋白的表現。 目標 4: 利用人類及 AR 基因剔除鼠的血小板，探討 AR 分別在 GPVI及 PAR4 所誘發細胞凋亡反 應中其所扮演的角色及其相關訊息傳遞作用。 透過本計劃的完成將使我們更清楚的了解 AR 在血小板活化過程中所扮演的角色，同時也提 供新的治療方向以防止體內動脈血栓的形成。