探討Wnt訊息與程序性細胞凋亡對脊髓運動神經迴路形成的影響(3/3)

神經系統的正常發育需要無數神經迴路的精準組裝，其中包含了一些重要的步驟，包括（1)軸突 生長錐被正確地引導，以及（2)神經族群大小的精密控制。透過細胞表面的特定物質所完成的高度軸 突引導特性，及隨後在產生錯誤或過多連結的神經元之中所發生的程序性細胞凋亡，都被推測與神經 迴路形成的精準控管有關。然而，對於複雜的神經迴路是如何形成，我們的了解還停留在初步的階段。 為了去探討這個問題，我們將試著去找出調控這些重要步驟的分子機制。 具擴散性的Wnt配體成員和它們的受體被指出可應用在許多重要的軸突引導過程中。但是，因為 被用來研究軸突引導的活體部位構造大多都很複雜，所以對於Wnt產生的訊息如何去影響軸突生長錐 的引導一直很難有精確的了解。因此，我們利用了一個構造相對簡單的活體部位，脊髓外侧運動神經 柱(lateral motor column, LMC)的運動神經元，來作相關的研究。這些神經元會在發育期間作出簡單的 兩種路徑選擇，而將他們的軸突延伸至背侧或腹侧的四肢肌肉組織。另一方面，當LMC神經元延伸 軸突至其目標肌肉群時，在四肢肌肉之中可以偵測出許多能讓運動神經元免於凋亡的神經滋養因子， 這暗示了神經滋養因子的組合對於避免運動神經的程序性細胞凋亡的重要性。 我們與其他實驗室發現，引導兩個LMC部位的神經元軸突的機制包含了對稱的ephrin排斥訊息。 此外，我們的初步研究結果也顯示了 Wnt配體成員與它們的受體分別表達在四肢肌肉以及LMC神經 元之中，這也暗示了它們在LMC軸突引導的角色。依據這些觀察結果，我們提出了以下的假設:在 LMC運動神經細胞中，正確支配四肢的神經迴路組織需要(A)具有雙功能的Wnt受體對LMC軸突所 產生的訊息，以及(B)程序性細胞凋亡，其發生與否是由[肌肉中的神經滋養因子]及[運動神經中的因子 受體]的組合編碼來決定。我們提議以下列的研究目標與方法去證明這個假設： 目標1:確定LMC神經細胞發育及軸突路徑的選擇是否需要Wnt及其受體 1.1以下列兩種動物模型檢驗，Wnt及其受體在LMC神經元軸突生長中的活體功能：（1)檢驗Wnt或其 受體的基因剃除小鼠及(2)利用雞胚胎電擊法將Wnt或其受體的表達量增多或減少。 1.2檢驗雞胚胎的LMC軸突，在過度表達正常或突變的Wnt受體的情況下所產生的生長反應。 1.3利用（1)神經逆向追蹤技術及(2)運動行為分析來檢驗，在Wnt或其受體的基因剃除小鼠中的LMC 軸突引導錯誤是否延續到成年時期。 目標2:確定Wnt及ephrin的訊息在LMC生長錐中的整合機制 2.1利用離體條紋分析去研究一些候選的Wnt訊息中間物質在失去功能後對LMC軸突引導的影響。 2.2利用離體條紋分析來確定LMC生長錐是否可以同時對Wnt及ephrin產生反應。 2.3利用生化分析及離體條紋分析來決定Wnt及ephrin的訊息是如何產生交集。 目標3:測試神經滋養因子的特殊組合模式是否能決定運動神經元的細胞凋亡 3.1利用原位雜交技術來檢驗，肌肉中的神經滋養因子及運動神經中的因子受體的表達狀況。 3.2利用（1)神經逆向追蹤技術及(2)雞胚胎電擊法來測試神經滋養因子的特殊組合模式，是否能決定運 動神經元的程序性細胞凋亡的發生。