斑馬魚毛細胞機械性感測傳導通道之研究

毛細胞為脊椎動物產生聽覺及平衡重要的細胞，其最大的特徵是將細胞頂膜的毛束 所產生之機械性動作轉換為電訊號傳回中樞，以產生相關之機械性感知，由於高等脊椎 動物毛細胞表現在內耳有不易觀察操作之缺點，因此近年發展以斑馬魚為毛細胞之研究 模式動物，斑馬魚毛細胞在結構上與功能上與哺乳類內耳之毛細胞皆極為相似且直接暴 露於體表(側線)具有直接觀察與操作的優點。毛細胞藉由頂膜毛束的運動拉動tip link 來 開啟毛束上的通道使得鈣離子流入，同時也能通透一些特殊的螢光染劑(如FM1-43)。 TRP channel 這個可以感測多種生理刺激(如冷、熱、痛、shear stress..等等)且以鈣離子為 主要通透離子的孔道家族被認為是毛細胞機械性傳導通道最有可能的候選人，其中 TRPN1、TRPV4、TRPA1 在線蟲、果蠅、小鼠等物種皆有被證明在毛細胞表現，在斑 馬魚的研究也發現這些基因對毛細胞的功能非常重要。然而在一些knockout mice 的實 驗當中卻有不同的結果，因此需要更詳細且系統性的實驗來證實。 申請人過去的研究當中，利用可以在活體胚胎體表測定離子流的掃描式離子電極技 術（Scanning Ion-Selective Electrode Technique; SIET）在斑馬魚成魚所取出的內耳中成 功測定H+離子流，建立了內耳之毛細胞氫幫浦(H+ ATPase)表現與其排氫功能的關係。 本研究計畫將進一步結合SIET 測定鈣離子流訊號的功能以及以morpholino knockdown 的方式抑制TRPN1、TRPA1、TRPV4 的蛋白質表現來觀察對斑馬魚毛細胞功能的影響， 配合FM1-43 染劑標訂、抑制劑的給予來觀察毛細胞的型態及功能變化，mRNA 及蛋白 質染色也將進一步提供分子表現證據。本研究計畫分三年執行： 第一年計畫目標---在預備實驗當中申請人已成功以SIET 活體測定出斑馬魚胚胎側 線毛細胞的鈣離子流入訊號，在計畫第一年目標以SIET 分析側線毛細胞在發育過程中 鈣離子流訊號的變化，並給予常用之機械性傳導通道抑制劑如amiloride 或Gd3+分析對 於毛細胞鈣離子流功能的影響，進一步以morpholino knockdown 的方式抑制TRPN1、 TRPA1、TRPV4 的蛋白質表現來觀察對鈣離子流訊號的影響並觀察對於胚胎發育，對聲 音的驚嚇反應，游泳行為，是否有破壞。 第二年計畫目標---探討TRPN1、TRPA1、TRPV4 在斑馬魚毛細胞的表現。在第二 年計劃中將進行TRPN1、TRPA1、TRPV4 的mRNA 在斑馬魚毛細胞之表現觀察，並利 用第一年計畫製作之抗體分析TRPN1、TRPA1、TRPV4 蛋白質在毛細胞上表現之位置， 預備實驗中已成功以活體染劑concanavalin A 標訂斑馬魚毛細胞之hair bundle，再利用 標訂毛細胞細胞本體的FM1-43 進行與孔道抗體的雙重染色，以了解TRPN1、TRPA1、 TRPV4 在毛細胞的表現位置及時間點。 第三年計畫目標---探討TRPN1、TRPA1、TRPV4在毛細胞上是否有合作、相互影響 機制。這三個TRP channel對於毛細胞整體鈣離子流運作關係，以及彼此之間為合作或是 拮抗的關係，將在第三年計畫實行。 本研究計畫將結合分子證據與細胞功能的證據，可以突破哺乳類研究的限制，建立 以斑馬魚毛細胞為研究機械性感側傳導通道之模式動物，同時提供毛細胞之機械性感測 傳導機制之系統性實驗證據。