探討C3H型鋅指蛋白質負向調控經由泛素化所活化的訊息傳遞

蛋白質的多重泛素化(polyubiquitination)是大多數蛋白質分解前必經的修飾作用，因此，傳統上泛素化被認為與蛋白質的穩定度有關。泛素由76個胺基酸所組成，序列中有7個lysines，依其序號稱為K6, K11, K27, K29, K33, K48及K63，當標的蛋白質進行多重泛素化時，第一個泛素通常接在標的蛋白質的lysine上，之後的泛素以其C端最終的glycine (G76)與上一個泛素的lysine相接連形成多重泛素，若接在上一個泛素的K48位置則稱為K48連接，以此類推，所以有7種類型的連接。目前發現蛋白質的分解多數與K48連接泛素化有關。而近來的研究發現泛素化在訊息傳遞上扮演極重要的角色，如生長因子活化Akt的過程中，Akt會進行K63泛素化，然後才被磷酸化而活化；又如在TNF活化NFB的過程中，RIP1 (receptor-interacting protein 1)需先被接上不同連接類型的泛素化，包括K11, K63及最新發現的M1直鏈連接，以吸引IKK複合体而磷酸化IB，因此活化了NFB。所謂的M1直鏈連接，是進行多重泛素化時，泛素間的相接不發生在lysine上，而是下一個泛素C端(G76)與上一個泛素N端第一個胺基酸methonine (稱M1)相接。 MCPIPs家族有4個成員，分別命名為MCPIP1-4，屬於C3H-type鋅指蛋白家族，為轉錄因子，皆具有CCCH zinc finger domain (與RNA結合有關)及NYN domain (具RNase活性)。MCPIP1是最早被發現的成員，受到發炎激素MCP-1 (monocyte hemotactic protein-1)誘導而表現，主要功能是抗發炎；而MCPIP4被發現在多種腫瘤組織中，有突變及表現異常的現象，被推定為腫瘤抑制基因。先前我們比較T3期的人類大腸直腸腫瘤組織與週邊正常組織，發現腫瘤組織MCPIP1及MCPIP4的mRNA有表現低下的情形，而過度表現MCPIP1及MCPIP4會導致細胞生長停滯甚至死亡，且我們也發現MCPIP1可抑制NFB的訊息路徑，而MCPIP4可抑制Akt的訊息路徑。此外，先前的研究發現MCPIP1及MCPIP4可能具有去除泛素鏈的能力，我們初步的結果發現MCPIP4可能經由去除Akt的泛素化而抑制Akt的訊息傳遞；而MCPIP1推測可能具有去除RIP1泛素化的能力，而抑制NFB的訊息傳遞，但詳細的機轉仍不清楚。基於近來的新發現及我們的初步結果，本計畫將在三年內完成下列目標: 第一年、調查MCPIP1及MCPIP4去除泛素鏈的能力及類型。我們將在試管及細胞中表現野生型及各種突變型MCPIP1及MCPIP4蛋白質，評估MCPIP1及MCPIP4去除泛素鏈的能力，以及利用免疫沈澱法及質譜分析技術找出MCPIP1及MCPIP4其他未知的泛素受質及結合的蛋白質。 第二年、探討MCPIP1及MCPIP4抑制Akt多重泛素化及腫瘤細胞生長之分子機制。除了K63泛素化，我們將試驗Akt是否發生其他連接類型的多重泛素化，以及MCPIP1及MCPIP4去除這些泛素化的能力。此外，將以腫瘤細胞及裸鼠實驗，試驗MCPIP1及MCPIP4抗腫瘤的能力及其分子機制。 第三年、探討MCPIP1及MCPIP4抑制與TNF/NFB路徑相關的泛素化之分子機制。我們將試驗MCPIP1及MCPIP4是否可經由抑制NFB的活化增加TNF所誘導的細胞凋亡，以及是否經由抑制RIP1及TRAF2/6的多重泛素化而抑制NFB的活性。