ORMDL3在thrombin誘導IL-8/CXCL8表現及呼吸道發炎之角色探討(1/3)

氣喘影響全世界人口約佔7%，每年因氣喘發作而死亡約有25 萬人。氣喘的特徵為呼吸 道發炎反應及呼吸道重組。Thrombin 是已知凝血因子，可從受傷血管釋放出來，在呼吸道發 炎扮演著重要的角色。先前的研究顯示，在氣喘病人氣管肺部灌洗液中thrombin 及 IL-8/CXCL8 量明顯增加，且與氣喘病情的嚴重度成正比。Orosomucoid 1-like 3 (ORMDL3)與 氣喘緊密聯繫在一起，它可經由過敏的作用誘導肺部上皮細胞大量表現。在小鼠過敏性氣喘 模式中，ovalbumin (OVA)經由ORMDL3 依賴ATF6 路徑誘發呼吸道的發炎反應。先前研究 指出AP-1 在調控IL-8/CXCL8 表現扮演著重要的角色。然而ORMDL3 依賴ATF6 訊息路徑 是否參與thrombin 誘導呼吸道上皮細胞AP-1 活化及IL-8/CXCL8 的表現目前還不清楚。許多 的研究指出ORMDL3 表現可經由CREB 及STAT6 路徑而來。然而，關於PDK1/RSK1 依賴 C/EBP活化參與thrombin 誘導ORMDL3 表現的角色還不清楚。我們初步結果顯示，thrombin 誘導IL-8/CXCL8-luciferase 活性或IL-8/CXCL8 釋放可受到細胞轉染單點突變c/EBP之IL-8 載體、ORMDL3 siRNA、ATF6 siRNA、curcumin (AP-1 抑制劑)及c-Jun siRNA 所抑制。Thrombin 誘導c-Jun 磷酸化及c-Jun 蛋白表現可被ATF6 siRNA 所抑制。Thrombin 誘導c-Jun 及ATF6 複合體的形成。Thrombin 誘導ORMDL3 蛋白的表現可被PDK1 siRNA、RSK1 siRNA 及 C/EBPsiRNA 所抑制。如此，本計畫中心假說為ORMDL3 媒介thrombin 誘導IL-8/CXCL8 表現及呼吸道發炎反應。 主題1 (第一年): 研究ORMDL3 在thrombin 誘導肺部上皮細胞AP-1 活化及IL-8/CXCL8 表現之角色 假說1: ORMDL3 媒介ATF6 的活化參與thrombin 誘導肺部上皮細胞AP-1 活化及IL-8/CXCL8 表現 1.1. 測試thrombin 誘導ORMDL3、ATF6 及c-Jun 表現情形 1.2. 使用抑制劑、主要突變載體及siRNA 來測試ORMDL3、ATF6 及AP-1 在thrombin 誘導 IL-8/CXCL8 表現所扮演的角色 1.3. 分析thrombin 誘導AP-1 活化經由ORMDL3/ATF6 或JNK 而來 主題2 (第二年): 研究PDK1/RSK1 依賴C/EBP活化參與thrombin 誘導肺部上皮細胞 ORMDL3 表現所扮演的角色 假說2: PDK1/RSK1 依賴C/EBP活化媒介thrombin 誘導肺部上皮細胞ORMDL3 表現 2.1. 使用siRNA 來測試PDK1、RSK1 及C/EBP在thrombin 誘導ORMDL3 表現所扮演的角 色 2.2. 使用刪除及單點突變方法分析在ORMDL3 之promoter 上的一個C/EBP結合位置 (-586/+1)在thrombin 誘導ORMDL3 的表現是必需的 2.3. 分析thrombin 誘導PDK1、RSK1 及C/EBP活化的情形 主題3 (第三年): 確定ORMDL3 在thrombin 誘導過敏性氣喘小鼠呼吸道發炎所扮演的角色 假說3: ORMDL3 媒介thrombin 誘導氣喘小鼠呼吸道發炎反應 3.1. 比較野生型及C/EBP剔除小鼠中thrombin 誘導肺部ORMDL3 表現量 3.2. 證明MicroSprayerTM aeroliser 方式給予ORMDL3 nkRNA 在thrombin 誘導過敏氣喘小鼠 KC 及MIP-2 (功能類似人類IL-8/CXCL8)釋放至氣管肺部灌洗液濃度的變化情形 3.3. 分析使用MicroSprayerTM aeroliser 方式給予ORMDL3 nkRNA 在thrombin 誘導過敏氣喘 小鼠其肺部ORMDL3 及c-Jun 表現和淋巴球、嗜伊紅球及杯狀細胞數量變化的情形