蘋果多酚成份phloretin誘發乳癌細胞凋亡之分子機制探討

惡性腫瘤蟬連台灣十大死因榜首已十幾年，死亡率為總死亡人數的第一位，其中 乳癌患者在所有癌症的死亡率由3.9%(70年)攀升到12.8％(95年)。最近文獻指出腫瘤細 胞會藉由提高葡萄糖利用，以利腫瘤細胞的存活(Meneses et al., 2008);固態腫瘤具有高 效率的醣解作用，並且相關的葡萄糖轉換受體和醣解酵素有過度表現的情況(Cao et al., 2007)。這些報告暗示乳癌細胞會因葡萄糖轉換受體或醣解酵素過度表現和高效率的 醣解作用以提高葡萄糖的利用幫助乳癌細胞生長(Crespi et al., 1999)。因此本計劃期望 利用乳癌細胞對葡萄糖的營養需求， 針對癌細胞表面之葡萄糖轉換受體 (Glucose-transporter, 簡稱GLUT)，利用專一性抑制劑以進行分子標靶治療，期待能達 到專一性抗癌目標。 先期結果簡要說明: 本實驗室利用雷射擷取顯微分離技術(Laser Capture Microdissection, 簡稱LCM)， 將正常與腫瘤細胞自癌組織加以分離(圖1A)並純化cDNA以進行real-time PCR定量分 析(圖1B)。應用此技術目前已經完成十例乳癌檢體分析，結果証實在國人乳癌細胞 中，二型葡萄糖轉運受體(簡稱GLUT-2)的表現量較正常乳房上皮細胞高約98.8倍(圖 1C)。經搜尋文獻後發現天然蘋果萃取成分(Phloretin, 簡稱為Ph)為GLUT-2抑制劑，初 步結果證實Ph可以誘發乳癌細胞進行細胞凋亡，而且血清中葡萄糖可緩解Ph之作用 (圖2,3)。利用乳癌細胞培養(圖4,5)或免疫缺憾鼠活體腫瘤模式均證實Ph具有顯著的抗 癌作用(圖6,7)。我們假設Ph可抑制腫瘤組織中GLUT-2受體，因此，將腫瘤老鼠進行 正子掃描(micro PET)分析後證實Ph可干擾GLUT-2對葡萄糖分子(18F-FDG)吸收達到 抑癌的效果(圖7)。合併臨床抗癌藥物(Paclitaxel, 簡稱PTX)可對Ph所誘發之乳癌細胞 凋亡(圖8~10)及活體抑癌作用(圖11)產生加成效果。 因此，本計畫利用乳癌細胞對葡萄糖代謝之需求，以細胞GLUT-2受體作為分子標 靶，利用Ph作為模式化合物，希望能探討其抑癌作用原理，建立癌症治療之學理基礎， 將來可以提供臨床醫師作為一種創新的化學治療思考模式。本計劃分三年擬完成下列 計畫目標: 第一年計畫: 國人乳癌組織中葡萄糖轉換受體表現與致癌相關性之研究 目標一、利用LCM技術觀察乳癌組織中GLUT-2表現: 1.乳癌檢體收集: 目前已收集近兩百五十例乳癌與正常組織(paired)樣本，利用LCM技術分離特定型 態之乳癌細胞，以real-time PCR技術分析國人乳癌組織中GLUT受體分型。 2.建立研究模式細胞株: 本計畫挑選二株基因表現迥異之乳癌細胞(MCF-7和MDAMB231)作為研究模式細 胞，理由如下:最近文獻報導指出女性荷爾蒙，尤其是estrogen影響乳癌細胞增生與抑 制細胞凋亡扮演極其重要的角色(Horii et al., 2007)。而MCF-7可表現estrogen receptor (簡稱ER)(Xie and Haslam, 2007)，反之MDAMB231則無法表現ER(Jo et al., 2007)。由 於ER表現為乳癌診斷非常重要的依據，ER分為兩類(ERα和ERβ，ERα的表現與乳 癌的形成有高度相關，ERβ多表現在正常的乳房細胞及良性腫瘤中(Shaaban et al., 2003)。此二株細胞剛好可以用來探討葡萄糖及其受體抑制劑所誘發抗癌訊息路徑下 ER在抗癌作用或致癌作用中扮演何種角色。因此我們建立了GLUT-2基因和ER基因 Adv-Tet-off過度表現與SiRNA抑制之乳癌模式細胞株 (詳見計畫書內文)。 3.組織微陣列晶片分析: 組織微陣列晶片技術可以同時用於評價數十例特定類型乳癌腫瘤樣本的GLUT-2 表現，為臨床預後提供判斷資料。 目標二、建立GLUT-2抑制(SiRNA)與過度表現(Tet-off)模式細胞株轉殖老鼠: 我們利用免疫缺陷(SCID)老鼠模式已建立乳癌腫瘤動物模式。本計劃將利用這些 模式進一步探討Ph之劑量、毒性乃至於最佳給藥模式。同時利用GLUT-2抑制(SiRNA) 與過度表現(Tet-Off)細胞株進行活體腫瘤模式實驗，利用正子掃描儀器(micro-PET)觀 察活體內GLUT-2表現與癌細胞生長之關連性。動物實驗之組織、檢體等將用來分析 並建立Ph藥物作用的學理基礎，探討Ph在活體腫瘤組織內的抗癌作用。 第二年計劃: GLUT-2抑制劑抑癌作用之分子機制探討 目標一、探討乳癌細胞GLUT-2之基因表現與細胞週期調控: 1. 建立研究模式細胞株: 建立了GLUT-2之Adenovirus SiRNA抑制(knock-down)及Tet-Off過度表現之乳癌模 式細胞株。 2.探討GLUT-2抑制劑如何抑制乳癌細胞週期變化: 本計劃希望探討GLUT-2受體抑制劑之抑癌作用，因此有必要先釐清血清中葡萄糖 的濃度是否影響Ph抑制乳癌細胞生長。初步研究成果證實Ph可誘發乳癌細胞凋亡(25%, 圖3A)，當血清中不含葡萄糖時，乳癌細胞對Ph的作用變得更加敏感(80%, 圖3A)，給 予葡萄糖(>20 mM)可完全抑制並緩解Ph的作用，而且原本細胞凋亡的現象變成G2/M 細胞週期抑制(圖3B)。Ph如何抑制乳癌細胞生長週期，必須在本計畫中釐清。利用 GLUT-2抑制(SiRNA)與過度表現(Tet-Off)之模式細胞株，我們希望能夠釐清Ph所調控 之乳癌細胞週期蛋白表現在GLUT-2抑制或表現之細胞株有何差異。 3.觀察活體內腫瘤組織之細胞週期蛋白表現: 第一年計畫所進行之腫瘤檢體將在第二年利用組織免疫染色或其他蛋白分析技術 觀察，並釐清活體內GLUT-2的表現被抑制是否與細胞週期蛋白調控有密切關聯。 目標二、探討GLUT-2抑制劑誘發細胞凋亡蛋白之調控: 1. GLUT-2抑制劑如何調控乳癌細胞凋亡相關蛋白表現： 我們初步結果已經證實Ph可以誘發乳癌細胞凋亡作用，而且血清中葡萄糖可干擾 之(圖2~3)。然而當同時給予兩種GLUT-2抑制劑(Ph + Cytochlasin B, 簡稱CB)時，可以 加強細胞凋亡的現象，此種作用仍然可以被葡萄糖(100 mM)所緩解(圖5A~C)。許多與 細胞凋亡相關的蛋白皆可以被Ph+CB所活化，而且葡萄糖可抑制這些蛋白的作用(圖 5D)。以上結果可見GLUT-2受體在Ph誘發乳癌細胞凋亡時扮演重要的角色。然而這些 細胞凋亡蛋白究竟如何被Ph所活化?葡萄糖如何藉由GLUT-2蛋白傳遞細胞存活的訊 息? 以及GLUT-2抑制或過度表現與Ph所調控之乳癌細胞凋亡蛋白表現有何關聯也是 本計畫極待釐清之課題。預計將分成1.粒線體傳遞路徑，2.Caspase receptor傳遞路徑， 3.內質網傳遞路徑等三階段探討。 2.活體內觀察GLUT-2所調控之轉錄因子如何影響細胞凋亡: 利用西方墨點法、核質分離技術、與共軛焦免疫染色法研究乳癌細胞GLUT-2致癌 訊息如何調控細胞凋亡相關蛋白表現。 第三年計劃: GLUT-2抑制劑治療乳癌之臨床意義與重要性探討 目標一、GLUT-2抑制劑合併抗癌藥物抑癌作用之可行性探討: 我們初步結果證實Ph(50 μM)與PTX(10 nM)在低劑量合併使用時可明顯誘發細胞 凋亡作用(圖8A*)，如果將Ph劑量提高(150~200 μM)則誘發凋亡之作用將更加明顯(圖 9*)。因此，我們將先於細胞培養模式評估Ph合併抗癌藥物之治療組合，對Ph與抗癌 藥物合併劑量與時間先有初步的結果後，進一步探討合併Ph與抗癌藥物誘發癌細胞凋 亡的分子機制探討，預計將分成1.粒線體傳遞路徑，2. Caspase receptor傳遞路徑，3. 內質網傳遞路徑等三階段探討。 目標二、GLUT-2抑制劑合併抗癌藥物抑癌作用之動物實驗模式建立: 我們利用腫瘤實驗動物模式亦初步證實合併臨床抗癌藥物(PTX)與GLUT-2 抑制 劑共同使用有非常明顯的抑癌作用(圖11)。因此，本計劃最終目標是希望以以極低劑 量的Ph和抗癌藥物得到良好的治療效果，降低藥物所引起的副作用。臨床抗癌藥物除 了PTX，另一類則是荷爾蒙藥物，具有抗雌性激素的功能。早在1896年Beatson利用荷 爾蒙療法治療乳癌(Baumann and Castiglione-Gertsch, 2007)，而Tamoxifen目前是最被廣 泛使用的ER modulator，過去文獻指出乳癌病患若有ER的表現，使用Tamoxifen治療 結果較佳(Hodges-Gallagher et al., 2007)。因此先以細胞培養模式尋找安全有效之治療 組合，進一步以動物實驗確認其活體內抑癌效果。同時確認Ph與抗癌藥物組合之最佳 給藥流程(例如調整實驗動物血糖濃度等等)，以降低合併藥物使用所產生之後遺症或 臟器毒性。 目標三、合併兩種以上GLUT-2抑制劑應用於乳癌治療之分子機制探討: 由於我們初步結果證實Ph可應用於抑制乳癌形成，而且其機轉初步證實是經由抑 制乳癌細胞GLUT-2受體。因此GLUT-2受體抑制劑似乎有潛力作為乳癌預防之目的。 由於Ph已知是由蘋果萃取之重要成分，是一種天然成分物質，其重要性更是不在話 下。如要證實我們的假說需針對GLUT-2抑制劑進行全面性的抗癌作用評估。例如 Genestein已知是一種GLUT-4抑制劑(Szkudelska and Nogowski, 2007)，出現在許多水果 成分中，已證實可以抑制乳癌細胞生長誘發乳癌細胞凋亡等。因此本計畫將在最後一 年針對已知GLUTs抑制劑(如Genestein, T-1095，Phoridzin，SB203580…等)進行細胞學 及腫瘤實驗動物模式評估，所得結果將有助於瞭解GLUT-2抑制劑應用於預防乳癌之 可行性。