乳癌細胞中a9-尼古丁乙醯膽鹼受體參與荷爾蒙拮抗劑(tamoxifen)治療所產生抗藥性之分子機轉探討

背景資料 1982 年起迄今二十餘年來，國人罹患乳癌的發生率急速增加了近50-100% 且罹患乳癌的年紀較西方國家婦女要早很多。研究發現國人乳癌發生與環境 因子、荷爾蒙(避孕藥)或藥物濫用、抽菸或接觸二手煙有關。由於乳癌細胞 生長與荷爾蒙需求有關，臨床上除了抑制女性荷爾蒙(estrogen, 簡稱E2) 合成，也可用荷爾蒙受體(estrogen receptor, 簡稱ER)拮抗劑如Tamoxifen (TAM)來進行治療。TAM 是ER+乳癌病患治療時的首選藥物，有報告指出 部分ER-病人也有療效。然而40% 的病人在TAM 治療後產生藥物抗性， 不明的機轉也造成治療失敗後死亡。 本實驗室先期結果: 本實驗室先期結果證實1.乳癌組織中α9 型-尼古丁乙醯膽鹼受體(nicotinic acetylcholine receptor, 簡稱α9-nAChR)有過量表現。利用基因干擾(RNAi) 技術證實該基因表現與尼古丁所引起之乳癌細胞生長有密切關連 (圖一~ 三)。2.癌組織中α9-nAChR 與ER+表現有明顯正相關(圖四)。3.細胞實驗證 實α9-nAChR 基因受到女性荷爾蒙或尼古丁誘發ERα等轉錄因子調控(圖五 ~六)。4.極低劑量TAM (10-100 nM)可誘發乳癌細胞甲型烯醇酶 (α-enolase, 以下簡稱ENO-1) (圖七)。TAM 誘發ENO-1 過度表現可抑制c-Myc 基因表 現，而c-Myc 蛋白是TAM 殺死乳癌細胞所需。5. 細胞實驗證實抑制ENO-1 可加強TAM 對癌細胞之毒殺作用(圖七~八)。6.Soft-agar 及活體動物實驗證 實ENO-1 過度表現使癌細胞對TAM 治療產生耐受性(圖九~十二)。以上結 果證實香菸所誘發的乳癌細胞α9-nAChR 藉由調控ERα改變ENO-1 表現， 此種改變與臨床上TAM 治療所產生的抗藥性有很有趣的關連(圖十三)。因 此，本計劃希望以三年期的時間完成並釐清多項研究目標如下: 2 第一年計畫: 國人乳癌組織α9-nAChR 和ENO-1 基因表現與TAM 抗藥性 之分子機制研究 目標一、利用 laser capture microdissection (LCM)技術擷取乳癌細胞， 並分析癌組織中α9-nAChR 和ENO-1 之表現: 1.乳癌檢體收集: 目前已收集近三百例乳癌與正常組織樣本(paired)，這些樣 本中有些是未經治療，有些則是TAM 治療後復發病人檢體。利用LCM， RT-PCR，real-time PCR 分析這些乳癌組織中α9-nAChR 與ENO-1 表現量 與各項臨床指標或治療預後之相關性。2.建立研究模式細胞株:本計劃選擇 MDAMB231(ER -/-)與MCF-7(ER +/+)細胞，此二株細胞對女性荷爾蒙(E2) 的反應迴異，作為TAM 之毒殺作用評估。本實驗室選用BD 公司Adeno-X Tet-off 系統作為載体，已經建立ENO-1與α9-nAChR基因抑制(knock-down) 及過度表現(Tet-Off)之乳癌細胞株(圖一、八、九)。為了研究TAM-抗藥性機 轉，我們根據先前所報告方法以長期、低劑量的方式建立TAM 抗藥性細胞 株(以下簡稱rTAM 細胞)。 目標二、研究 TAM 抗藥性與ENO-1 基因表現之轉錄因子調控: 1.建立ENO-1 基因之promoter luciferase reporter system: 將ENO-1 基因 promoter 分成四個主要片段(1019, 700, 542, 266- ENO-1 promoter)以鑑別 轉錄因子之調控區域 (圖七)。2.研究ENO-1 promoter 是否受到尼古丁或荷 爾蒙調控: 利用CHIP 技術已證實ERα為ENO-1 之轉錄因子(圖七B、C)。 3.觀察TAM 如何活化抗藥性細胞株之轉錄因子(例如ERα)進而調控ENO-1 基因表現: 初期結果證實 TAM 可以誘使ENO-1 promoter 之活化 (圖七)。 尼古丁或女性荷爾蒙如何透過α9-nAChR 將抗藥性之訊息傳遞至細胞核內 部?它所傳遞的訊息又是如何? ENO-1 哪些promoter 區域會受到調控?這些 問題有待本計劃解決。 3 第二年計畫: 探討乳癌細胞α9-nAChR 蛋白與TAM 治療抗藥性之分子機轉 目標一、利用基因干擾(SiRNA)與過度表現(Tet-Off)之乳癌細胞株研究TAM 誘發之抗藥性機轉: 1.乳癌研究模式細胞株之建立: 本實驗室已經建立α9-nAChR、ENO-1 之 SiRNA 與Tet-Off 細胞株。低劑量TAM 誘發之抗藥性(rTAM)細胞株在第一 年可完成。2. 研究尼古丁與E2 刺激後ENO-1 如何改變細胞週期與凋亡蛋 白之表現：已知文獻證實ENO-1 可抑制c-Myc 基因表現，而c-Myc 蛋白是 TAM 殺死乳癌細胞所需之重要調控蛋白。利用SiRNA 或Tet-Off 細胞株探 討尼古丁與E2 刺激下，ENO-1 如何改變c-Myc 或其他細胞凋亡相關蛋白 之表現。由於先期結果證實SiRNA 抑制ENO-1 導致細胞生長減緩(圖七C， 圖八D)，此細胞株將做為研究之模式細胞，證實ERα和NFκB 是否調控 ENO-1 之基因表現而改變癌細胞生長特性 (圖七H)。 目標二、建立 TAM 抗藥性細胞株研究α9-nAChR 之訊息傳遞: 本計畫將利用TAM 誘發之抗藥性(rTAM)細胞株做為研究模式細胞，利用基 因干擾(SiRNA)與過度表現(Tet-Off)技術改變此細胞內ENO-1 之表現。1. 研 究α9-nAChR 所誘導之轉錄因子(ERα和NFκB)在TAM 抗藥性細胞內如何 cross-talk。在TAM 抗藥性細胞中由尼古丁和女性荷爾蒙所誘導之ERα可能 和許多連結蛋白在細胞內形成複合物。因此、是否還有其他轉錄因子參與? 這些ERα複合物如何轉錄活化ENO-1 基因? ENO-1 promoter 活化位置在 哪裡? 許多有趣的問題有待解決。2.研究TAM 抗藥性細胞內ENO-1 與 α9-nAChR 如何影響細胞凋亡蛋白表現：利用西方墨點法、核質分離技術、 與共軛焦免疫染色法以TAM 刺激後觀察細胞內凋亡蛋白變化。3.觀察TAM 抗藥性細胞內α9-nAChR 所誘發之轉錄因子(如ERα，NFκB)如何調控 ENO-1 表現：利用CHIP 技術證實這些轉錄因子調控細胞凋亡蛋白之表現。 第三年計畫: 活體內證實乳癌細胞α9-nAChR 蛋白表現決定TAM 之臨床治 4 療效果 目標一、利用α9-nAChR 模式細胞株轉殖鼠評估TAM 治療效果: 1.基因抑制(knock-down)與過度表現(Tet-Off)之活體腫瘤模式建立:為了能 在活體內探討α9-nAChR 參與TAM 抗藥性作用機轉，利用第一年所建立之 基因抑制(SiRNA)與過度表現(Tet-Off)細胞株轉殖入免疫缺陷(SCID)老鼠， 評估TAM 治療效果 (圖十~十二)。以TAM 抗藥性細胞株(rTAM)作為對照細 胞。2.活體內α9-nAChR 之表現與TAM 藥物治療效果評估。給予TAM 腹腔 注射，希望證實在活體內改變α9-nAChR，是否能影響癌組織生長的速度。 3.利用抑制(SiRNA)與過度表現(Tet-off)動物模式研究ENO-1 之致癌訊息傳 遞。由於c-Myc 可受到ENO-1 抑制，因此、c-Myc 相關訊息調控蛋白之表 現有必要在活體內探討。 目標二、活體腫瘤模式研究α9-nAChR 對TAM 抗藥性之訊息傳遞: 由於α9-nAChR 在活體內的表現與ER+有正相關性(圖四A、B)。而且 α9-nAChR 可透過ER 調控ENO-1 基因之活化(圖七A)。ENO-1 是一個糖 解酵素，它可能透過抑制c-Myc 蛋白影響癌細胞凋亡，對細胞內部能量的 代謝與腫瘤的存活也必須要考量。因此，希望藉由活體實驗之控制條件，取 得適當的腫瘤組織，進行酵素活性與相關分子鑑別，期能發現更為重要之分 子機轉。1. 腫瘤組織內 α9-nAChR 抑制或過度表現相關之訊息傳遞與細胞 週期蛋白觀察。2.腫瘤組織內與ENO-1 相關之訊息傳遞與細胞週期蛋白表 現之觀察。3.以microarray 方法分析TAM 誘發之腫瘤抗藥性相關訊息傳遞 與細胞週期蛋白表現之觀察。所得到的結果將有助於臨床上設計特定功能的 藥物，達到預防或治療之效果。也可以針對部分乳癌病人作進一步治療策略 的開發，或作為診斷與癒後之參考。