探討細胞自噬作用與血基質氧化(第一型及第二型)於腦損傷之角色:從活體到細胞機制

撞擊性腦創傷（TBI）發生的原因如車禍（尤其在台灣機車之使用頻繁）、高處墜落、運動或休閒活動所造成的傷害，其死亡率極高，且約有半數的存活者伴隨著癱瘓或其它後遺症。TBI造成腦組織損傷之機制之一是因顱內壓升高而造成腦缺血，當顱內壓降低，則血液再灌流，故TBI 與缺血/再灌流（I/R）雖病因不同，但病理機制相似。細胞自噬作用(autophagy)是真核細胞中清除老化蛋白質及受損胞器的一種方式，認為是對抗壓力引起細胞損傷的細胞自救機制，但如果壓力過大時，自噬作用過度活化，仍會導致細胞死亡。神經元損傷後壞死、凋亡之文獻已經很多，但神經細胞死於自噬作用直到最近二年來才備受矚目。已有證據顯示急性腦損傷會提高細胞自噬作用；然而，細胞自噬作用在腦創傷所扮演的角色仍不清楚。血基質氧化酶(HOs)主要是將血紅素解降解為膽綠 (biliverdin) (其隨後被 biliverdin reductase 轉化為bilirubin)、二價鐵 (Fe2+)、與一氧化碳而達到細胞保護的效果。HO-1 與 HO-2具有相同功能，但基因與調控機制均有明顯差異。腦損傷後誘發細胞自噬和HOs之活性(包括誘導HO-1蛋白質表現量及增加HO-2活性)時程可能不一樣，是互相加強或互相排斥迄今尚無文獻，值得探討。 於本三年計畫我們擬利用(並比較)二種腦損傷動物模式(皮質撞擊創傷或腦缺血/再灌流) 及利用細胞培養(初代培養的神經/膠質、星狀膠質、微膠及微血管細胞) 受到氧化壓力或刮傷，於傷害後不同時間點，研究細胞自噬作用和Heme oxygenase (HO-1 與 HO-2) 系統之角色。第一年(2010/08/01~2011/07/31) : 主要研究細胞自噬作用於腦損傷之角色。先用細胞培養研究細胞受到氧化壓力(H2O2)或刮傷(scratch wound injury)造成細胞死亡，於不同時間點之死亡程度，並區別死亡的方式(壞死、凋亡、自噬)。加入自噬作用 抑制劑(3-MA ，10 mM)是否緩和或加重細胞死亡程度?加入rapamycin(0.01 ~ 5000 μM，抑制mTOR)，或 wortmannin 、LY294002 LY (PI3K抑制劑)以釐清自噬作用其上、下游路徑。再於動物實驗比較於二種腦損傷動物模式(單側TBI或I/R), 動物於腦傷後1、4、7天接受跑步滾輪(rotarod)測試運動協調功能及貼紙試驗評估前肢觸覺功能後犧牲，腦組織切片以Fluoro-Jade 及 cresyl violet 染色評估神經細胞損傷程度，另一組動物犧牲後腦組織進行生化分析以評估自噬作用在不同的時間點誘發之程度，以及給予自噬作用抑制劑--例如3-MA (300μg/3μl，腦室注射)--是否會緩和或是增加腦組織損傷的情形。針對特定機制之上下游分子，找出於腦損傷後之路徑及藥物。第二年(2011/08/01~2012/07/31) :主要研究 Heme oxygenases (HO-1 and HO-2) 於腦損傷之角色。 擬於二種腦損傷動物模式先研究HO-1及HO-2在受傷腦組織周圍不同細胞種類之分佈與表現(及時程變化) ，再研究腹腔注射給予HO之抑制劑後(SnPP 30 mg/kg，或 ZnPP 50μmol/Kg)或HO-1誘導劑(例如hemin 30 mg/kg 或CoPP 5 mg/kg, i.p)是否會緩和或是增加組織損傷的情形？是否會緩和或是增加細胞自噬作用? (HO-1 or HO-2於腦損傷是否調節細胞自噬作用?) 由於HO活性抑制劑會同時抑制HO-1及HO-2，故我們擬給予腦室注射shRNA for HO-1 or HO-2，選擇性的known down HO-1或HO-2蛋白質表現 (以腦組織切片免疫組織染色確認之)，以釐清HO-1及HO-2個別之角色。第三年(2012/08/01~2013/07/31) : 主要研究細胞自噬作用Heme oxygenase(HO) 於腦損傷是否互相調節 三種明確保護功能藥物(Baicalein, G-CSF, Vitamin C)是否有部分經由對自噬作用或HO-1或HO-2之調節? 或使用抑制劑或促進劑調節自噬作用(或HO)是否增加或抑制神經保護劑(Baicalein, G-CSF, Vitamin C….等)的作用? 根據最近的文獻報告指出目前有八種藥物（當中的七種是FDA已核可的臨床用藥）可以促進細胞自噬作用，因此我們認為細胞自噬 (或HO)的相關藥物可以應用在幫助腦損傷病人的復原。相信本研究將增進我們對於細胞自噬在腦損傷方面的知識，並為藥物研發開啟了一道曙光。