膜性腎絲球腎炎疾病模式中自噬作用的機制研究--從活體動物到人類之研究

膜性腎病變是造成成人腎病症後群最常見的原因.膜性腎病變的臨床病程以緩慢不 明顯表現佔大多數,但仍有部分病人會進展至末期腎臟疾病(ESRD).其中末期腎臟疾病 的發生率五年約14%,十年約35%,十五年約40%.儘管目前越來越多的研究投入膜性腎病 變,但其致病的機轉到目前尚未了解清楚.最近的研究指出持續性的腎絲球硬化以及足 細胞的損傷可能是腎絲球病變和末期腎臟疾病的造成主因. 到目前為止,自噬作用在膜性腎病變中所扮演的角色還未知.近期的研究發現以雷 帕霉素這種藥物抑制特定酵素(mTOR)會造成自噬作用的升高,進而延緩腎絲球疾病的發 生,包括了局部性腎絲球硬化,膜性腎絲球腎炎,糖尿病腎病變等.因此,細胞自噬作用被 認為對細胞存活或是組織恆定扮演著極為重要的角色.我們的初步結果也於膜性腎病變 小鼠證實隨著時間變化自噬作用蛋白表現逐漸增強的現象.因此,我們假設自噬作用表 現可能與訊息傳遞蛋白(如mTOR/PI3K class I, PI3K class III/BECN1 和 BNIP3/HSPIN1 等)相關.為了探討自噬作用在膜性腎病變過程中的致病角色,我們提出此三年期計畫,以 動物及人類模式為主要研究對象去探討自噬作用蛋白質及其相關之訊息傳導路徑.以下 為本計畫重點: (A)第一年：以cBSA誘發小鼠膜性腎病變,並於不同時程分析其自噬作用蛋白,且同 步觀察可能具有療效之藥物 1.收集不同時間點膜性腎病變小鼠之腎臟組織,來研究膜性腎病變中自噬作用 蛋白的變化 2.利用顯微鏡觀察不同時間下自噬小體(以MDC,一種自噬小泡的追蹤劑染色) 在膜性腎病變病程中的變化情形 3.運用自噬作用抑制劑/誘發劑探討自噬作用在膜性腎病變中的重要性 4.測試8種美國藥物及食品管理局所核可的藥物,是否對自噬作用蛋白及自噬 小體有誘導生成作用 5.在生化及組織學的分析下,確認並驗證此8種美國藥物及食品管理局所核可 的藥物所誘導之自噬作用程度是否與疾病的嚴重程度有關 (B)第二年：以cBSA誘發小鼠膜性腎病變,於不同時程分析自噬作用相關訊息傳遞 蛋白,研究何種細胞可能表現自噬作用,並進一步以單一細胞株驗證 1.根據第一年動物實驗所獲得的結果,我們將選出特定的時間點探討膜性病變 中與自噬作用相關之訊息傳遞蛋白(如mTOR/PI3K class I, PI3K class III/BECN1和 BNIP3/HSPIN1等) 2.利用螢光雙染的方法,探討自噬作用蛋白,訊息傳遞蛋白及自噬小體會表現 在何種細胞?如足細胞(細胞標定蛋白為podocalyxin),腎小管細胞(標定蛋白 為Tamm-Horsfall protein)及膈細胞等 3.使用不同的細胞株(像是膈細胞,足細胞及腎小管細胞等等)觀察並分析不同 時間點自噬作用蛋白,訊息傳遞蛋白及自噬小體的表現情形 4.再次利用螢光雙染的方法,於特定細胞株內不同時間點下,探討自噬作用蛋 白,訊息傳遞蛋白及自噬小體之間的相互關係 (C)第三年:分析膜性腎病變病人,其自噬作用蛋白及訊息傳遞蛋白的變化情形 1.研究膜性腎病變病人及其對照組[收集非腎絲球疾病病人(如腎癌)之正常腎 臟部分檢體]自噬作用蛋白及訊息傳遞蛋白之變化情形 2.利用螢光雙染的方法,探討膜性腎病變病人腎臟組織中,自噬作用蛋白,訊息 傳遞蛋白及自噬小體會表現於何種細胞 3.在生化及組織學的分析下,確認自噬作用及訊息傳遞蛋白表現程度是否與疾 病的嚴重程度有關