血小板粒腺體參與調節細胞凋亡、壞死及自我吞噬的機轉探討

粒腺體在調節細胞凋亡及壞死方面扮演非常重要的角色；細胞壞死是一種被動形式 的細胞死亡，這種形式的細胞死亡有下列幾個特徵：ATP 耗損、細胞腫大以及細胞膜崩 潰(collapse of plasma membrane)等；另外，細胞凋亡亦有數個特徵包括產生DNA 片段 (DNA fragmentation)、染色體凝縮 (chromatin condensation) 以及phosphatidylserine (PS) 的曝露等。在需要caspase 產生(caspase-dependent)的細胞凋亡路徑中，細胞激素(例如： TNF-α or Fas-L)會結合到細胞膜上的死亡受體(death receptors)，並且聚集DISC (death-inducing signaling complex)；在粒腺體所參與的細胞凋亡途徑中，Bax/Bak 會形成 一個管道，這個管道准許多個蛋白從粒腺體中釋放到細胞質。在不需要caspase 產生 (caspase-independent)的細胞凋亡路徑中，apoptosis-inducing factor (AIF)和endonuclease G (Endo G)會從粒腺體轉移到細胞核中，並且促使DNA 形成小碎片。在細胞凋亡以及 細胞壞死的過程中，粒腺體通透性轉換(mPT)會造成粒腺體細胞膜的瓦解；粒腺體通透 性轉運孔(mPT pore)主要是由依賴電壓調節的陰離子通道(voltage-dependent anion channel)、ATP/ADP 交換器(adenine nucleotide translocator)、cyclophilin D (CypD)以及一 些分子所構成；鈣離子和氧化壓力(oxidative stress)所誘導細胞壞死的過程會被CypD 和 mPT 所調節。另一方面，在細胞自我吞噬(autophagy; 又稱為self-eating)的過程中，mTOR 活化酵素 (the mammalian Target of Rapamycin Ser/Thr kinase)的抑制活性會被抑制 (de-repression)，進而啟動自我吞噬的作用；其中有兩種類泛素系統(ubiquitin-like conjugation systems)會參與囊泡延長(vesicle elongation)的過程，其中之一為Atg (autophagic factor)12 和Atg5 形成共價結合，另一個為phosphatidylethanolamine 與 LC3/Atg8 形成共價結合(LC3 為Atg8 的mammalian homologues)，此結合會促使游離形 式LC3 (LC3I)轉換成結合到吞噬囊泡的LC3II；LC3II 常當做細胞自我吞噬的標記，接 著autophagosomes 會與lysosomes 融合而形成成熟的autolysosomes。 血小板是一種無核細胞，它在血栓及凝血過程中扮演很重要的角色；有趣地，血小 板亦發現有類似的細胞凋亡現象產生。目前研究證實血小板會表現數個caspases、死亡 受體(death receptors)和Bcl-2 家族；我們初步的研究結果亦證實血小板活化劑(例如： thrombin)會明顯地誘導血小板PS 的曝露、粒腺體的去極化(Fig. 1)和刺激caspase-9 和-3 的活化(Fig. 2)；這些類似細胞凋亡的反應暗示著細胞凋亡的發生是不一定需要有細胞核 來參與反應的。此外，細胞核轉錄因子，NF-κB，在細胞凋亡反應中扮演重要的角色； 在正常的狀態下，IKKβ 會活化IκB 和同時刺激NF-κB 由細胞質轉移到細胞核中，最近 我們實驗室首度證實以amyloid β刺激血小板會誘導IKKβ的磷酸化(Fig. 3)以及IκBα的 2 分解(Fig. 4)，接著會引起NF-κB (p65 和p50)從細胞質轉移到粒腺體中(Fig. 5)，並且結 合到粒腺體DNA (mtDNA)上(Fig. 6)。這個結果暗示著除了細胞核外，轉錄因子也有可 能作用在別的細胞區的DNA 上(例如：粒腺體)；因此在無核細胞中，NF-κB 結合到 mtDNA 上可能對調節細胞凋亡扮演某些特殊的角色。 資料顯示粒腺體在調節細胞凋亡、壞死及自我吞噬過程中扮演某些重要角色；但是 在無核的血小板細胞中，它如何來進行細胞凋亡、壞死及自我吞噬作用目前研究仍很 少；同時血小板中的粒腺體在其發生凋亡、壞死及自我吞噬的過程中所扮演的角色目前 亦不清楚。因此，本計畫將系統性地探討這些問題，同時也想進一步瞭解血小板是否會 發生自我吞噬作用。 Specific aim 1: 探討Bax 相關的訊息傳遞路徑在血小板進行細胞凋亡過程中所扮演的 角色 (Fig. 7). Hypothesis 1: Bax 會從血小板細胞質中轉移到粒腺體細胞膜上，進而造成粒腺體通透性 轉換(mPT)，並且誘導cytochrome c、 Smac/Diablo、 HtrA2/Omi、 apoptosis-inducing factor (AIF)和endonuclease G (Endo G)的釋放，接著 cytochrome c, apoptosis protease activating factor-1 (Apaf-1)和 procaspase-9 會形成凋亡小體 (apoptosome), 最後會活化caspase-9 和 -3。 1.1 研究是否Bax 會從人類血小板細胞質中轉移到粒腺體細胞膜上。 1.2. 評估從人類血小板純化出來的粒腺體，recombinant Bax (rBax)是否會刺激其產生 粒腺體通透性轉換 (mPT)。 1.3. 探討rBax 誘導cytochrome c、Smac/Diablo、HtrA2/Omi、AIF 和Endo G 的釋放。 1.4. 研究rBax 刺激血小板粒腺體DNA (mtDNA)產生小碎片(fragmentation)的情形。 1.5. 研究並且比較正常小鼠(wild-type mice)與Bax 基因剔除小鼠(Bax-/- mice)對於粒腺 體DNA (mtDNA)產生小碎片、粒腺體通透性轉換(mPT)、PS 曝露、caspase-9 和 -3 的活化以及Smac/Diablo 和HtrA2/Omi 的釋放的差異性。 Specific aim 2: 探討是否cyclophilin D 依賴性的粒腺體通透性轉換(mPT)主要發生在調 節血小板細胞壞死的過程中而不是發生在細胞凋亡的過程 (Fig. 7). Hypothesis 2: 缺乏 cyclophilin D 的細胞可能對於ROS (reactive oxygen species)和鈣離子 多載( Ca2+ overload)所誘導之細胞壞死具有一定的耐受性 (resistance)，但是對於各種細 胞凋亡刺激劑所引起的刺激(例如：Bax)一樣會導致正常的死亡。 2.1. 研究在血小板活化的過程中，cyclophilin D 是否在調節粒腺體通透性轉換(mPT) 上扮演重要角色。 2.2. 分別比較由細胞壞死刺激劑(Ca2+和H2O2)與細胞凋亡因子(rBax)所引起的人類血 3 小板粒腺體的腫大、粒腺體通透性轉換(mPT)和cytochrome c 釋放的差異性。 2.3. 比較並且分析正常小鼠(wild-type mice)與cyclophilin D 基因剔除小鼠(Cyp-/- mice) 的血小板對於Ca2、H2O2 和rBax 所分別誘導之粒腺體通透性轉換(mPT)、 cytochrome c 釋放、PS 曝露、caspase-9 和 -3 活化的差異性。 Specific aim 3: 探討血小板細胞質中的NF-κB 轉移到粒腺體後，結合到粒腺體內的 DNA (mtDNA)，調節某些蛋白質表現進而引起細胞凋亡反應(Fig. 7). Hypothesis 3: 刺激無核細胞(血小板)能誘導IKKβ磷酸化及IκBα的分解，接著會引起 ΝF-κΒ從細胞質轉移到粒腺體中，此時ΝF-κΒ會進一步經由調節粒腺體基因的表現來調 控粒腺體的功能。 3.1. 研究人類血小板IKKβ磷酸化及IκBα分解的詳細作用機轉。 3.2. 確認血小板的NF-κB會從細胞質轉移到粒腺體中，同時結合到粒腺體DNA (mtDNA)的NF-κB-like 結合序列上。 3.3. 研究轉移的NF-κB結合到mtDNA上的NF-κB-like 結合序列後，會經由調節某些特 殊蛋白質(如ND4, NADH dehydrogenase)表現，進而引起血小板細胞凋亡反應(如 粒腺體膜電位減少以及引起caspases 活化)。 Specific aim 4: 探討參與細胞自我吞噬的微小物質是否存在於人類血小板細胞中(Fig. 7). Hypothesis 4: 血小板可能會表現 beclin-1、LC3 (Atg8)、Atg5 及Atg12 的 mRNA 和蛋白 質；同時，H2O2能夠促進beclin-1、Atg5 及Atg12 的蛋白質合成，並且促使游離形式的 LC3I 轉換成結合到吞噬囊泡的LC3II (細胞進行自我吞噬的重要標記)。 4.1. 研究beclin-1、LC3 (Atg8)、Atg5 及Atg12 的mRNA 和蛋白質會在人類血小板細 胞中表現。 4.2. 分析H2O2 是否能夠促進beclin-1、Atg5 及Atg12 的蛋白質表現，並且刺激LC3I 轉換成LC3II。 4.3 利用電子顯微鏡觀察血小板受到 H2O2 刺激後，是否會促使細胞自我吞噬囊泡 (autophagic vacuoles)的形成。 透過研究這些調控機轉的知識能夠提供我們一個合理的理論基礎，以便能進一步了解在 無核細胞(血小板)中，粒腺體參與細胞凋亡、壞死以及自我吞噬作用的情形以及三者間 不同的機轉及差異性。