水飛薊對殺菌劑造成精子功能異常的調節機制探討: 磷酸蛋白質體的研究

哺乳類動物精子需要經過所謂活能化 (capacitation)方具有受精功能。而活能化精子可繼 而進行頂體反應 (acrosome reaction)呈現過動現象。白蛋白及微量過氧化氫能促進精子 活能化進而活化cAMP/protein kinas A 而後續進行訊息蛋白磷酸化。實驗性接觸環境荷 爾蒙譬如具雌激素或抗雄激素作用的物質被認為具改變雄性生殖功能，但過量過氧化氫 或不同環境荷爾蒙對蛋白分子的影響機制仍較不清楚。本研究計畫旨在分析過量過氧化 氫或不同環境荷爾蒙對白蛋白所活能化小鼠精子的影響；進而了解待測化學物質對小鼠 精子蛋白質磷酸化表現的作用機制。在第一年，首先利用磷酸蛋白質體來進行蛋白質磷 酸化的分子鑑定，以確認體外過量過氧化氫對小鼠精子蛋白磷酸化的影響；並比較不同 小鼠品系反應的差異。過量過氧化氫所造成的影響是否經由cAMP 路徑則與活能化精子 蛋白磷酸化表現進行探討。精子蛋白磷酸化的類別及磷酸化的特定胺基酸位置則進一步 確認，尤其針對 outer dense fiber 1 (ODF1)、CG031 以及A-kinase anchoring protein 4 (AKAP4) 的精子蛋白質。所應用的分析技術包含免疫沉澱法(immunoprecipitation)、二 維電泳分析法(two-dimensional gel- electrophoresis) 以及免疫細胞化學法 (immunocytochemistry)；尤其針對較為新穎的 CG031 蛋白質。於第二年，則針對過量 過氧化氫或具環境荷爾蒙特質的化學物質對的小鼠精子所造成的蛋白質磷酸化改變情 形之調節機制進行探究。所待測具環境荷爾蒙特質的化學物質包括免克寧(vinclozolin)、 水飛薊萃取物 (silymarin)；前者為一種殺菌劑且已知會造成AKAP4 前驅蛋白質的過量 表現，後者則被認為同時具有葡萄糖與雌激素作用的調節功能。本研究將繼而利用Cdk5 活化物來檢測過量過氧化氫對ODF1 磷酸化的影響是否與Cdk5 作用路徑有關，而 silymarin 調節精子蛋白磷酸化的作用是否與PKC 路徑則利用PKCα 抑制劑來測試。前 述等不同培養條件對精子的蛋白結構與活能化/頂體反應功能的影響，則分別同時測定來 分析蛋白磷酸化關聯性；silymarin 對精子保護作用則同時以活體投予來測試。本研究所 利用磷酸蛋白質體研究結果期許未來能應用作為非侵入診斷男性不孕因子，並可用來進 行藥物是否具回復生育功能的評估。