網膜色素上皮細胞之氧化傷害：粒腺體之角色及以粒腺體為標的之蛋白質類抗氧化物之保護作用

老年性黃斑部退化為造成老年人不可逆的視力障礙之最重要原因，該病之原因雖仍 不完全明確，但一般認為反應性氧類（reactive oxygen species；ROS）所造成的對網膜 色素上皮細胞(retinal pigment epithelium)的氧化壓力在其致病機轉上扮演重要的角色。 在細胞內粒腺體消秏絶大部分的氧氣來產生腺嘌呤甘三磷酸（ATP）以提供細胞所 需之能量。在粒腺上的電子傳遞鏈上，若有電子之滲漏（leak）至氧分子上，就可以產 生ROS。因此粒腺體是處於一個極活躍的ROS 生產之環境中。另一方面，粒腺體本身 的去氧核糖核酸（DNA）由於缺乏histone 之保護以及DNA 修復機制較不健全，也特別 易受到ROS 的傷害。在我們的初步研究中，我們利用過氧化氫（H2O2）建立了網膜色 素上皮細胞的氧化壓力毒性的模型，在我們的研計畫中，第一項特定目標（Specific aim） 就是利用此模型來探討氧化壓力對於網膜色素上皮細胞中的粒腺體的影響（包括粒腺體 的DNA 完整性、粒腺體的型態、粒腺體的膜電位及ATP 的產量）。 在細胞內，粒腺體在細胞的死亡機制上也扮演重要的角色，一方面細胞凋亡的執行 常需要細胞色素（cytochrome c）自粒腺體內釋出後，才可以進行之後之caspases 活化 的細胞凋亡執行階段。另一方面，粒腺體主司細胞內ATP 的產生，而ATP 的含量是決 定細胞死亡時走向哪一個機轉的重要因素（ATP 足夠時走向細胞凋亡，ATP 不足時走向 壞死）。因此對於氧化壓力在網膜色素上皮細胞上產生毒性時，是導致cytochrome c 釋 出走向細胞凋亡，還是因氧化壓力導致粒腺體產生之ATP 下降而走向壞死的途徑？這個 問題的研究將是研究計畫的第二項特定目標：亦即研究氧化壓力對網膜色素上皮細胞造 成細胞死亡之機制，以及氧化壓力強度對此細胞死亡機制之決定有什麼影響。 由於老年性黃斑部退化被認為和氧化壓力有關，因此有許多研究在探討各種抗氧化 物的攝取可否減少或減緩老年性黃斑部病變的的發生。在這方面各種研究得到的結論並 不一致。事實上，許多抗年化物並不易進入細胞內，因而不易增加細胞抵抗氧化壓力的 能力。近來，有一類新的胜肽類抗氧化物被合成，其為交替連接的芳香烴胺基酸及鹼性 胺基酸所構成，被認為可以在粒腺體內高度集中。在過去我們的研究中，我們發現利用 類黃酮中的quercetin 可以減少網膜色素上皮細胞的光激發毒性（一種ROS 造成之毒 性），其EC50 之濃度介於25-30μm 之間。在本研究中，我們將研究這類胜肽類抗氧化物 於網膜色素上皮細胞遭遇氧化壓力時的保護作用，並和其他種類之抗氧化物比較其效 力，這將是本計畫的第三項特定目標。而為了將來能在人體及臨床上的應用，還必考慮 這類胜肽類抗氧化物可能造成的網膜色素上皮細胞毒性，因此本研究的第四項特定目標 為：決定出這類胜肽類抗氧化物對網膜色素上皮細胞之安全濃度範圍（亦即產生細胞毒 性的門檻），藉以確定這類胜肽類抗氧化物對於氧化壓力毒性的有效及安全濃度範圍。 另一方面，雖然這類胜肽類抗氧化物在其他細胞（如Caco-2 細胞及N2A 細胞）內 的分布已有所了解，但其在網膜色素上皮細胞內的分布則並未有過研究，因此本計畫的 第五項特定目標為探討網膜色素上皮細胞對這類胜肽類抗氧化物之吸收情形以及胜肽 類抗氧化物在網膜色素上皮細胞內之分布，尤其要注重的是和粒體之間的關聯。 一個可能且重要的ROS 的來源就是位於老化的網膜色素上皮細胞中分解微粒 (lysosome)內的脂褐質(lipofuscin)。脂褐質為一種光激發物質(photosensitizer)，當網膜色 素上皮細胞累積了長時間的光線暴露後，會造成光激發毒性。在過去的研究中，我們利 用acridine orange 及藍色光的照射建置了網膜色素上皮細胞的光激發毒性的模型，我們 之所以選用acridine orange 乃因其和脂褐質一樣，會集中於分解微粒（lysosome）中。 因此在此模型中，ROS 的大量產生將是在lysosome 及其附近（因為ROS 在被反應而消 秏前之平均路徑只有14 nm），因此我們有興趣想要了解胜肽類抗氧化物對於這種網膜 色素上皮細胞的acridine orange 光激發毒性模型是否具有保護作用，而其光激發毒性保 護作用與其他種的抗氧化物，在效力(potency)方面的比較上如何？這將是本研究的第六 項特定目標。 另一方面，在過去我們對循血綠的網膜色素上皮細胞毒性的研究中發現，粒腺體有 腫大，內部皺摺（cristae）喪失，粒腺體的膜電位差下降，ATP 生產減少。而過去的報 告也顯示循血綠會抑制粒腺體的呼吸作用，這些現象讓我們推測循血綠可能會增加網膜 色素上皮細胞內ROS 的濃度，而這項推測也在我們初步的實驗中獲得證實。因此下一 步我們想了解是否這些胜肽類的抗氧化物可以減少循血綠對網膜色素上皮細胞的毒 性，這將是本研究的第七項特定目標，而本項特定目標的研究結果，也可以讓我們對循 血綠對網膜色素上皮細胞毒性機轉有更深入的了解以及有可能找出另一種減少臨床上 循血綠對網膜色素上皮細胞毒性的方法。 由於現今臨床上對於老年性黃斑部退化的治療成效仍十分有限，因此有許多的研究 致力於找出能預防此疾病發生或惡化的方法，或者試圖拯救已受損的網膜色素上皮細胞 及感光細胞。我們提出的研究計畫在改善預防及處理老年性黃斑部退化的方法上將具有 臨床的應用價值。總結而言，本研究計畫預定以三年的時間達成以下各項的明確目標。 第一年 1. 第一項特定目標：探討氧化壓力對於網膜色素上皮細胞中的粒腺體的影響（包括粒腺 體的DNA 完整性、粒腺體的型態、粒腺體的膜電位及ATP 的產量）。 2. 第二項特定目標：研究氧化壓力對網膜色素上皮細胞造成細胞死亡之機制，以及氧化 壓力強度對此細胞死亡機制之決定有什麼影響。 第二年 3. 第三項特定目標：研究胜肽類抗氧化物於網膜色素上皮細胞遭遇氧化壓力時的保護作 用，並和其他種類之抗氧化物比較其效力。 4. 第四項特定目標：決定出胜肽類抗氧化物對網膜色素上皮細胞之安全濃度範圍（亦即 產生細胞毒性的門檻），藉以確定這類胜肽類抗氧化物對於氧化壓力毒性的有效及安全 濃度範圍。 第三年 5. 第五項特定目標：探討網膜色素上皮細胞對胜肽類抗氧化物之吸收情形以及胜肽類抗 氧化物在網膜色素上皮細胞內之分布，尤其要注重的是和粒體之間的關聯。 6. 第六項特定目標：了解胜肽類抗氧化物對於網膜色素上皮細胞的acridine orange 光 激發毒性模型是否具有保護作用，而其光激發毒性保護作用與其他種的抗氧化物，在效 力(potency)方面的比較上如何？ 7. 第七項特定目標：了解是否這些胜肽類的抗氧化物可以減少循血綠對網膜色素上皮 細胞的毒性。