gamma-Aminobutyric acid 調控血小板活化,細胞凋亡及自體吞噬作用的機轉探討: NF-kappaB在無核細胞中non-genomic功能的新角色(3/3)

-Aminobutyric acid (GABA)是中樞神經系統最主要的抑制性神經傳導物質，同時亦存在於周 邊組織和血液中。GABA 受體主要分成三種類型：A、B 和C 型，其中GABAA 型為最重要屬於 ligand-gated chloride channel。血小板在動脈性血栓中扮演重要的角色，研究發現某些benzodiazepine 類藥物可經由不同的作用機轉來抑制血小板凝集反應；然而關於GABA 本身對血小板功能的研究 則相對較少。最近有研究指出GABA 在4 M 濃度下可加強血小板凝集反應，然而我們初步研究 結果顯示，GABA 在相對較低濃度下(0.5～1 M)會明顯抑制血小板凝集反應和細胞內鈣離子的釋 放(圖1 及2)。對照人體血漿中GABA 的濃度約為98.6±33.9 ng/ml (相當於0.7-1.3 M)，所以在此 生理濃度下的GABA 會呈現抑制血小板凝集的活性，因此我們相信它是體內防止動脈栓塞的重要 內生性物質。使用電子顯微鏡觀察發現GABA 會大量地分布於血小板細胞質內(圖3)；同時初步利 用LC-MS/MS 分析發現血小板內含有大量的GABA (大約是1.03 ng/106cells) (圖4)，此結果暗示著 血液中的GABA 有一部份來自於受刺激的血小板所釋放。最近我們也發現細胞核中重要的轉錄因 子NF-B 亦存在於無核的血小板細胞中(圖5)，它可從細胞質進入粒線體(圖6)，並結合至粒線體 DNA (mtDNA)，但接下去的作用仍不清楚，此結果暗示著可能NF-B 在一般所知的轉錄調控作用 之外，亦存有另一種全新的非基因性調控作用(non-genomic function)來調控無核細胞的訊息傳遞作 用，但此假設仍待進一步證明。此外目前已證實無核的血小板亦會發生細胞凋亡(如粒線體功能障 礙，caspase 活化等)和細胞自體吞噬 (LC3II 的表現等)的現象。最近我們也發現GABA (0.5 和1 μM) 可明顯抑制血小板的NF-B 和caspase 3 的活化(圖5 及7)。因此血小板可說是研究NF-B 在無核 細胞中非基因性調控作用的最佳標的細胞(如研究血小板活化、細胞凋亡和自噬作用)。我們的初步 結果已證實GABA 在調節血小板活化和細胞凋亡中扮演了重要的角色，然而其詳細的作用機轉以 及NF-κB 所調控的非基因性作用是否亦參與其中至今仍不清楚，因此本計畫將首次有系統性地探 討這些問題(圖8)。 具體目標1 (第一年)：利用LC-MS/MS 及毛細管電泳儀(CZE)進一步精確定量血小板中GABA 的含 量；並以穿透性電子顯微鏡(TEM)觀察血小板中GABA 的確實分布位置(如是否存在於 granules、 dense granules 或open canalicular system 中)；同時深入探討GABA 抑制血小板活化的詳細作用機轉 並確認血小板上是否有GABA 受體的存在；同時評估在活體內是否有抗血栓的活性。 具體目標2 (第二年)：探討GABA 抑制血小板的作用是否與調控NF-B (p65/p50)的活化有關(如 IKK磷酸化、IB降解和p65 磷酸化)；同時進一步釐清NF-B 與GABA 所引發的一連串訊息傳 遞路徑(如cyclic nucleotides，PLCγ2-IP3-PKC 和MAPK 等)之間的上下游關係。 具體目標3 (第二年)：利用分離的血小板粒線體與NF-B 結合序列(5'-AGTTG AGGGG ACTTT CCCAG G -3')或者位於mtDNA 上的NF-B-like 結合序列(5’-ACATC ATTAC CGGGT TTTCC TCTTG TAAAT-3’)進行EMSA 或者ChIP 分析，以進一步證實NF-B 是否會轉移至粒線體並與其 上的mtDNA 結合，進而調控一些粒線體內與細胞凋亡有關的蛋白表現(如cytochrome c oxidase III 或NADH dehydrogenase 4 等)。此外我們也將觀察GABA 是否會抑制NF-B 的轉移及結合作用並 進而影響mtDNA 調控蛋白的表現。 具體目標4 (第三年)：在人類或者NF-B 基因剔除(NF-B-/-)鼠的血小板中，探討NF-B 是否在調 控Bax 所引發的相關細胞凋亡途徑(如mPT、AIF、Endo G、apoptosome 產生、caspase 活化及mtDNA 裂解等)上扮演核心角色，同時評估GABA 對上述細胞凋亡反應的抑制活性是否與NF-B 有關。 具體目標5 (第三年)：研究在活化的人類血小板或者NF-B 基因剔除(NF-B-/-)鼠的血小板中， NF-B 是否會參與細胞自體吞噬作用(如beclin-1、LC3/Atg8、Atg5 和Atg12 表現及autophagic vacuoles 的產生等)，同時並探討GABA 是否會經由抑制NF-B 的活化進而抑制上述這些細胞自體 吞噬反應。 透過本計劃將能使我們更清楚的了解到GABA 在體內對血小板的影響，同時也能了解到 NF-B 在無核細胞中所扮演的另一種非基因性調控作用的角色。