Ketamine於脂多醣所活化巨噬細胞中可能具有抗發炎作用之分子機轉研究

加護病房病人因格蘭氏陰性菌感染而造成的敗血症(sepsis)，是臨床上嚴重而且具生命威脅 的重症。各種手術後病人或是多重感染患者，都有可能轉變成內毒素敗血症。脂多醣 (lipopolysaccharide; LPS)是格蘭氏陰性菌產生的內毒素，在之前的許多研究中都認為，此一內毒 素是造成病人罹患敗血症的一個重要因素。敗血症患者體內免疫細胞被LPS 活化後，會釋放大 量的發炎細胞素(inflammatory cytokines)和一氧化氮(nitric oxide; NO)到血液和組織中，因而可能 造成敗血症患者併發多重器官衰竭。 在臨床外科手術過程中，ketamine 是廣泛被使用的靜脈麻醉藥物之一。而在成癮藥物中， ketamine 亦是目前於台灣常被濫用的成癮藥物之一。先前的研究證實，ketamine 會抑制白血球 (leukocytes)和嗜中性細胞(neutrophils)的黏附(adherence)和移動(migration)能力。所以，ketamine 被認為對於患者可能具有免疫調控(immunomodulation)作用。巨噬細胞(macrophages)是體內免疫 系統中的重要成員，當身體受到感染時，巨噬細胞會因刺激(stimulated)而被活化(activated)。於 此同時，巨噬細胞細胞亦會釋放發炎細胞素(inflammatory cytokines)，呼朋引伴更多的免疫細胞， 齊力消滅病原菌。本實驗室先期研究結果顯示，ketamine 在臨床濃度下，雖然不會造成細胞死 亡，但卻會抑制巨噬細胞吞噬和氧化能力，並具有抑制發炎細胞素tumor necrosis factor-α (TNF-α)、interleukin 1-β (IL-1β)和IL-6 基因表現的能力。雖然先前研究已有對ketamine 如何調 控TNF-α 生合成加以探討，但有關於ketamine 如何影響IL-1β 和IL-6 基因表現的分子機轉，則 尚未有相關的研究報告被提出。 LPS 活化巨噬細胞生成發炎細胞素的路徑中，首先LPS 需先和LPS-binding protein (LBP)結 合，結合後的複合體會去鍵結活化膜蛋白上的CD14，然後再活化Toll-like 受體(Toll-like receptors; TLRs)。TLRs 是type I transmembrane proteins，其媒介LPS 誘導巨噬細胞生成發炎細胞素TNF-α, IL-1β and IL-6 的機制，主要分成調節分子(adaptor) MyD88-dependent 和 -independent 的兩種路 徑。其中在MyD88-dependent 的路徑中，LPS 會鍵結CD14 和TLRs 以活化MyD88，再經由 TRAF-6-MKK-MAPK 和TRAF6-IKK- IκB-NF-κB 兩種途徑，分別產生AP-1 和NF-κB 等轉錄因 子(transcriptional factors)，此轉錄因子會再鍵結到發炎細胞素基因5’端的promoter 上，以誘導這 些基因的表現。而於MyD88-independent 的路徑中，LPS 經由鍵結CD-14 和TLRs 後，則會活 化蛋白分解酵素caspases，促使caspases 作用於發炎細胞素的前趨物(precursor)，使其轉化成細 胞素。由本實驗室之前的研究發現，ketamine 對於LPS 活化巨噬細胞後所誘導生成的發炎細胞 素具有抑制作用。然而，ketamine 是透過何種分子機制，以抑制LPS 活化誘導巨噬細胞生成發 炎細胞素IL-1β 和IL-6 基因表現，則尚未被瞭解。所以，本研究計畫將延續先前的研究，探討 91/10/30 修訂 2 ketamine 的抗發炎分子機制。 本計畫為三年連續型研究計畫，以購自美國ATCC 類小鼠巨噬細胞株(Raw 264.7)為實驗模 式，探討ketamine 於LPS 活化巨噬細胞中，可能生成抗發炎的分子機制。第一年主要研究目標 為1)以光譜分析儀探討ketamine 是否能與LPS 產生鍵結作用，以降低LPS 活化巨噬細胞的能 力；2)探討ketamine 是否會干擾LPS、LBP 和CD-14 的間的鍵結作用；3)分析ketamine 是否會 藉由影響TLR4 的表現，進而降低LPS 的活化。第二年研究目標為1)以基因轉殖(cloning)和RNAi 技術評估TLR4 於巨噬細胞中傳遞LPS 訊號之角色。2)以分子生物之方法探討ketamine 是否會 影響LPS 所活化之MyD88-dependent pathway (由MyD88 至AP-1)，研究之訊息傳遞因子包括 MyD88、TRAF-6、MKK、MAKP、AP-1。第三年研究目標則為1)以分子生物方法評估ketamine 是否會影響LPS 活化巨噬細胞另一MyD88-dependent pathway (由MyD88 至NF-κB)，研究之訊 息傳遞因子包括MyD88、IKK、IκB、NFκB；2)以生化反應與分子生物之方法探討ketamine 是 否會調控LPS 所活化之MyD88-independent pathway，研究因子主要為caspases。期待經由此一 分子機制之探討，將能更瞭解ketamine 所產生的抗發炎的機轉。並透過此一基礎的研究，應可 進一步認識敗血症患者在進行外科手術麻醉時，可能發生的藥物交互作用。