脂肪細胞對心房細胞之離子及心電生理變化調控之研究

在新陳代謝症候群及肥胖病人身上可觀察到心房顫動發生頻率增加之情形。肺靜脈及左心房在 心房顫動的誘發或維持扮演重要的角色，而心臟周邊脂肪恰位於肺靜脈及左心房常見的誘發點附近。 心臟周邊脂肪具有促發炎能力，而發炎可能引起心房顫動發生，因此脂肪細胞可能在心房心律不整的 發生扮演重要的角色。關於脂肪細胞在心肌細胞電生理及各種離子調控之分子生物機轉則未有研究。 異常的離子調控已知是造成心房顫動以及肺靜脈引發心律不整之重要原因，研究已知ryanodine receptor (RyR)的功能異常以及鈉鈣離子流交換增加或鈣離子回收幫浦功能受損，可能誘導肺靜脈之心 律不整活性並引發心房顫動，且自發的非傳遞性之(nonpropagating)鈣離子釋放及鈣離子亮點(spark)在 心房顫動的病理生理學機轉也扮演重要的角色，此外protein kinase C (PKC)為鈣離子調控之樞紐，然 而對於脂肪細胞是否影響肺靜脈心肌細胞與心房細胞之鈣離子調控與protein kinase C 並未清楚地研 究。由於adiponectin 被發現可減少心房顫動發生，是否adiponectin 可調控脂肪細胞功能則未可知， microRNA 為基因調控之重要工具，透過microRNA 之分析可進一步瞭解脂肪造成心房顫動之機轉。 故本實驗主要在探討脂肪細胞是否能直接調控左心房與肺靜脈心肌細胞離子流、動作電位與鈣離子調 控分子生物機轉。故本計畫第一年的研究目的在探討脂肪細胞對於肺靜脈心肌與心房細胞的電生理特 性並比較不同部位脂肪細胞之差異。第二年的實驗中，我們將探討脂肪對於肺靜脈心肌與心房組織之 傳導特性影響，與鈣離子調控蛋白表現。第三年我們將進一步探討脂肪細胞對於HL-1 心肌細胞訊息 傳遞的表現與途徑，並透過經由protein kinase C 訊息傳遞，研究adiponectin 在調節脂肪細胞功能與治 療心房顫動所具備的潛力。第四年將分析脂肪細胞對於 HL-1 心肌細胞microRNA 之影響以及調控機 轉。實驗方法：第一年實驗藉著灌流分解酵素到兔子心臟而分離出單一肺靜脈心肌細胞及左心房肌細 胞，並以切碎法加上分解酵素將左心房後之心臟周邊脂肪，腹部皮下脂肪分解為脂肪細胞共置4~6 小 時後。利用全細胞箝制技術比較測定每一組之單一肺靜脈心肌細胞及左心房肌細胞之動作電位(Action potential)、各種離子流 (ionic currents) 的變化、有無自動節律，並藉著比率式螢光技術測定每一組之 單一肺靜脈心肌細胞及左心房肌細胞內鈣離子濃度、利用共軛焦顯微鏡來測量控制組與實驗組的細胞 內鈣離子濃度、鈣離子螢光亮點、 transient [Ca2+]i，並加以比較分析其在心房與肺靜脈心肌細胞於控 制組或加脂肪細胞實驗組之變化與不同部位脂肪細胞之差異，並藉著adipokine array 測定脂肪細胞分 泌之細胞激素。第二年實驗藉微小多電極定位系統(MED64 Multi-electrode system)及傳統電生理實驗於 肺靜脈心肌及左心房肌組織測量其組織間傳導速率與電生理特性 (含局部激發時間傳導速度傳導圖譜 以及頻譜分析等)。使用西方墨點法及RT-PCR 偵測RyR、 NCX、 phospholamban、calmodulin kinase II、以及SERCA2a 的RNA 與蛋白質表現。第三年實驗對有無與3T3-L1 脂肪細胞共同培養下之HL-1 心肌細胞，用細胞箝定實驗測量動作電位與離子流比較有無adiponectin 以及protein kinase 抑制劑 (Go6976)使用下之差別，並用西方墨點法實驗以偵測 protein kinase C、 phospho-p38/ERK、 p38/ERK、 TGF-之蛋白質與RNA 表現以及protein kinase C 活性。第四年實驗：對有無與3T3-L1 脂肪細胞共同 培養下之HL-1 心肌細胞，藉miRNA microarray 及real-time PCR 測量微小RNA 表現， 並分析調控此 微小 RNA 對細胞內鈣離子濃度、鈣離子螢光亮點、 transient [Ca2+]i，與鈣離子調控蛋白質表現。