Apelin對左心房與肺靜脈心肌細胞之電生理特性及鈣離子調控與心房顫動之致病機制研究(2)

Apelin是新發現作用於APJ受體的一種肽類，與angiotensin II–angiotensin II第一類受體的作用途 徑相似。Apelin具有周邊血管擴張與增加心肌收縮的作用，並可能影響中央體液的衡定。動物與人體 研究顯示Apelin可能藉由調節angiotensin II的作用，在心臟衰竭與心房顫動的病理機轉中，扮演重要的 角色。在心臟衰竭與心房顫動的病人中，Apelin的血清濃度下降，但在左心室重塑的過程中，Apelin 的血清濃度上昇。 在臨床上心房顫動是最常見的一種心律不整原因，並且容易引發心臟衰竭及中風。研究發現Apelin 的濃度下降是造成心房顫動的危險因子，但為何Apelin濃度下降的患者罹患心房顫動比率增加的病理 生理機轉仍尚不清楚。肺靜脈心肌細胞在心房顫動的發生中扮演著重要的病理角色，因為肺靜脈心肌 細胞具有高度心律不整活性。然而對於Apelin在肺靜脈心肌細胞電生理的影響所知甚少。另外，異常 的鈣離子調控也可能對於肺靜脈誘發心房顫動的發生扮演重要角色，研究已知ryanodine receptor (RyR) 的功能異常以及鈉鈣離子流交換增加或鈣離子回收幫浦功能受損可能誘導肺靜脈之心律不整活性並 引發心房顫動，然而對於Apelin影響肺靜脈心肌細胞與心房細胞之鈣離子調控並未清楚地研究。先前 的研究已知自發的非傳遞性之(nonpropagating)鈣離子釋放及鈣離子亮點(spark)在心房顫動的病理生理 學機轉也扮演重要的角色; 因此，Apelin也可能調節鈣離子亮點並進而影響心房電生理及肺靜脈心肌 細胞之心律不整活性。綜合上述，雖然肺靜脈與左心房在心房顫動的角色已知，但Apelin在對於肺靜 脈與左心房電生理特性的影響仍待進一步的研究。 故本計畫第一年的研究目的在探討Apelin對於肺靜脈心肌與心房細胞的電生理特性(動作電位、節 律性與離子流)之影響。第二年的實驗中，我們將探討在Apelin對於肺靜脈心肌與心房細胞中，RyR的 功能、鈣離子調控、鈣離子亮點與鈣離子調控蛋白 (L型鈣離子通道, NCX、RyR、SERCA) 表現量。 第三年我們將進一步探討Apelin 在心肌細胞上下游訊息傳遞的表現與途徑， 並透過經由 mitogen-activated protein kinases路徑引發心房顫動的藥物(Isoproterenol, Angiotensin II)，研究Apelin在 治療心房顫動所具備的潛力。 實驗方法：第一年實驗：利用酵素灌流可分離兔子之心房與肺靜脈心肌細胞，加入apelin (0.1, 1, 10 nM) 4~6小時後，使用全細胞箝定實驗記錄細胞之動作電位、L型鈣離子流、暫時性離子內流、暫時性外向 鉀離子流、鈉鈣交換離子流、內向及延遲加強型鉀離子流，並加以比較分析其在心房與肺靜脈心肌細 胞於控制組或加apelin實驗組之差異。第二年實驗：從分離單一肺靜脈心房肌細胞中，加入apelin (0.1, 1, 10 nM) 4~6 小時後，以共軛焦顯微鏡以及鈣離子螢光來測量細胞內的的[Ca2+] transient, [Ca2+] store, [Ca2+]亮點,，另外，進一步藉著西方墨點法實驗以及RT-PCR，用以偵測鈉鈣離子交換幫浦，SERCA、 RyR、L型鈣離子通道之蛋白質與RNA的表現方式。第三年實驗：從分離之單一肺靜脈與心房肌細胞 有無加入apelin (0.1, 1, 10 nM) 4~6小時後，比較使用isoproterenol (10 nM)或angiotensin II (100 nM)後用 細胞箝定實驗測量動作電位與離子流於控制組或加apelin實驗組之變化，並用西方墨點法實驗以偵測 phospho-p38/ERK and p38/ERK之蛋白質表現。且以培養之HL-1細胞有無接受缺氧(1% O2) 2 小時後， 以RT-PCR測量apelin與apelin接受器之RNA表現，並用ChIP assay及promoter reporter gene Assay評估 HIF-1調控apelin之機轉。 初步研究結果：發現apelin (1 nM)可以抑制肺靜脈心肌細胞之自動性與L 型鈣離子流，研究結果顯示 apelin 確有調控心肌電生理之作用。