哺乳動物Sumoylation機制與功能之探討

本實驗室過去研究 sumoylation 機制時，有幾項重要的發現：(1)SUMO1 以長鏈 (poly-SUMO1)結合於 Topoisomerase I 上；(2)經 SUMO修飾之酵母 Ubc9其酵素活性降 低；(3)SUMO1活性受磷酸化之調節。本計畫延續先前的研究成果，欲探討 Sumolyation 酵素蛋白之調控機制。如，哺乳類 Ubc9 經 SUMO1 修飾後，其生物活性之變化，並探討 SUMO1之磷酸化如何影響 sumoylation之活性。 有三個主要目標： 一：研究哺乳類 Ubc9被 SUMO修飾後之活性及生理功能。 我們初步研究發現，酵母菌的 Ubc9被 SUMO修飾後會抑制 Ubc9的活性。但在 Knipscheer等人的報告中，哺乳動物之 Ubc9被 sumoylation後，對不同受質卻有不同 效應。再者，我們的初步數據顯示，酵母菌與哺乳動物的 Ubc9其 sumoylation修飾位 置不同。這促使我們想要釐清哺乳動物與酵母之 Ubc9經 SUMO修飾後，是否會有不同的 Ubc9活性，進而影響其在 sumoylation的調控。這方面分為三個部分進行: 1. 鑑定哺乳動物 Ubc9其 SUMO修飾的位置。 2. 分析哺乳動物 Ubc9不同位置之 SUMO修飾是否會影響其轉移 SUMO的活性。 3. 利用哺乳動物系統研究 Ubc9被 SUMO修飾後的生理功能。 二：研究 SUMO1被磷酸化調控和 sumoylation的關係。 我們發現 SUMO1可被 protein kinase A (PKA)磷酸化。且被磷酸化修飾後的 SOMO1相 較於無修飾的SUMO1，增加特定受質之sumoylation。本計畫擬探討磷酸化和sumoylation 之間的關係。主要分為三個部分: 1. 鑑定 SUMO1被磷酸化修飾的位置。 2. 探討磷酸化之 SUMO1如何調節 sumoylation。 3. 進一步測試其他激酶是否會磷酸化 SUMO1，進而調控 SUMO1 sumoylation。 三：鑑定 SUMO1之 poly-SUMO1接合位置，並以細胞實驗來研究 poly-SUMO1聚合鍵結的 生理功能。 蛋白質經 ubiquitin在不同 lysine上的修飾，導致不同的生理功能。因此，我們認 為不同位置的 poly-SUMO1聚合鍵結也許會造成不同的生理功能，所以我們要探討 poly-SUMO鍵結分支點的功能。研究主要分為三個部分進行: 1. 鑑定 SUMO1中，哪一個 lysine是形成 poly-SUMO1聚合鍵結的分支點。 2. 建構 shRNA-resistant SUMO1 plasmid，且此質體上只保留一個 SUMO1結合位。 3. 檢視不同分支點的 SUMO1聚合鍵結是否會產生不同的生理功能。