Pitx2c於心房和纖維母細胞的附基因調控作用與心房顫動之治療機轉探討(2/2)

經由全基因組相關性研究(genome wide association study)，PITX2、ZFHX3 與KCNN3 等三個基因被發 現與心房顫動的發生有相關性，其中4q25 染色體上鄰近Pitx2c 的核苷酸變異，與心房顫動的發生最 具顯著關聯性。Pitx2c 主要表現在左心房與肺靜脈心肌細胞，可能具有調控心房結構與電生理功能。 研究顯示，附基因調控機制參與心房顫動的發病機制。越來越多的證據顯示，由組蛋白去乙醯酶（histone deacetylase）調控的組蛋白和非組蛋白修飾參與心房顫動的發生，而Pitx2c 被發現可藉由招募組蛋白 去乙醯酶而調控胚胎發育。此外，我們先前的研究亦顯示，組蛋白去乙醯酶抑製劑可減輕心肌纖維化， 並藉由影響多重因子而改善心房顫動。microRNA (miRNA)具有調控電生理與鈣離子的功能，然而， Pitx2c 是否會影響組蛋白去乙醯酶活性及miRNA 之表現則未有清楚研究。因此本研究旨在探討Pitx2c 的附基因調控作用及對心衰竭之心房電生理與心肌結構重塑機轉，以釐清Pitx2c 在心房顫動或心衰竭 所扮演的角色。在第一年的實驗中，將探討是否高度表現 Pitx2c 可以影響miRNA 的表現及組蛋白去 乙醯酶活性，以及能否減少心衰竭產生之心房結構與電生理重塑。在第二年的實驗中，將藉由共同培 養纖維母細胞和心房心肌細胞以探討高度表現 Pitx2c 是否可以調控心肌細胞電生理特性和鈣調控蛋 白的表現。 實驗方法：第一年的實驗，我們將分析組蛋白去乙醯酶活性並藉由使用miRNA array 比較增加Pitx2c 表現(Pitx2c overexpression)以及對照組之HL-1 細胞，配合real-time PCR 定量的方式，偵測目前已知可 能與心房顫動或心衰竭相關miRNA 的表現量差異。我們亦將於HL-1 細胞藉由細胞箝定與鈣離子螢光 染色探討Pitx2c 是否可減少快速電刺激(5 Hz，6 小時)誘導的電生理改變。此外，藉由開胸手術，直接 於心衰竭鼠左心房注射empty plasmid 或Pitx2c encoding plasmid，並於DNA 注射後第7 天與14 天取 出心臟進行組織切片染色、傳統玻璃微電極、高密度訊號分析與西方墨點法，以偵測其心肌纖維化、 電生理學、電生理傳導以及比較這些細胞的鈣離子調控蛋白表現之差異。第二年的實驗中，我們將藉 由共同培養HL-1 細胞與心房纖維母細胞 (包括正常HL-1 與纖維母細胞、正常HL-1 與高度表現Pitx2c 的纖維母細胞及HL-1 與纖維母細胞皆高度表現等三組)利用全細胞箝定、共軛焦顯微鏡測量增加Pitx2c 表現以及對照組的HL-1 細胞動作電位(Action potential)、各種離子流的變化以及鈣離子螢光之表現並 使用西方墨點法比較這些細胞的離子流與鈣離子調控蛋白(SERCA2a 、ryanodine receptor 、 sodium/calcium exchanger、calcium calmoduline kinase II、total & phosphorylated phospholamban)的表 現差異，並探討Pitx2c 是否可減少快速電刺激(5 Hz)誘導的電生理改變。 初步成果：Pitx2c 可改變心房纖維母細胞之移動能力。相較於控制組，增加Pitx2c 表現之心房纖維母 細胞，其細胞移動能力降低；反之減少Pitx2c 表現之細胞，則移動能力增加。此外， Pitx2c knockdown 之心房纖維母細胞的通道蛋白connexin 40 (Cx40)及Cx45 亦會減少，這些初步成果顯示Pitx2c 或可藉 由改變纖維母細胞活性而影響心房電生理與心房顫動發生。