ZFHX3基因對心房電生理調控及分子生物機轉研究與心房顫動之關聯性(2/3)

心房顫動(atrial fibrillation)是一種在臨床上常見的心律不整之症狀，通常會導致心衰竭並且增加死 亡的風險。近年來已有許多利用全基因組關聯性研究（genome-wide association studies, GWAS）來 探討疾病發生可能機制的研究。其中，在心房顫動的研究中可以觀察到三個基因，分別為PITX2、 ZFHX3與KCNN3與疾病發生可能有相關聯性。其中PITX2與KCNN3在心律不整與心衰竭上已有研究 被報導，然而對於ZFHX3在心肌細胞與心律不整中所扮演的角色與功能目前尚未明瞭。本實驗室利 用siRNA干擾技術，已成功地降低HL-1細胞中ZFHX3的表現，而在ZFHX3被抑制的心房細胞中， 可以觀察到一個鈣離子調控蛋白SERCA2a的表現量下降。由於SERCA2a負責將鈣離子從細胞質轉 運到肌漿網內，借以調控鈣離子的平衡，而SERCA2a與鈣離子調控於心房顫動之病理生理機轉扮 演相當重要角色，因此這些初步研究結果顯示ZFHX3對心房電生理與心房顫動之生成應有相當之重 要性。然而ZFHX3如何調控心房電生理之分子生物機轉與訊息傳遞路徑皆未清楚，因此本計劃將 探討ZFHX3如何影響心房電生理與鈣離子調控，以釐清ZFHX3在心房顫動所扮演的角色。在第一 年的實驗中，我們將調控ZFHX3在HL-1細胞的表現，藉以探討ZFHX3基因於心房電生理與鈣離子 調控或心房顫動生成所扮演的角色。在第二年的實驗中，我們將探討ZFHX3在HL-1細胞中如何調 控心房電生理與心房顫動生成之訊息傳遞路徑與分子生物機轉。在第三年的實驗中，我們將探討心 房纖維顫動相關的miRNA是否會受ZFHX3調控。以及檢視已知的危險因子是否透過ZFHX3影響 miRNA在HL-1細胞的表現，並引發心房顫動。 實驗方法: 第一年的實驗，我們將先選殖出HL-1細胞中ZFHX3基因的全長，並且構築over-expression 的載體。將構築好的載體與siRNA分別轉染HL-1細胞，並且篩選得到穩定的轉殖細胞株。利用全細 胞箝制技術測定轉殖細胞株的動作電位(Actionpotential)、各種離子流(L type calcium current, sodium current, transient outward current, ultra repaid and delayed rectifier potassium current, inward rectifier potassium currents) 的變化以及有無自動節律或 激發活性(triggered activity)現象。並利用共軛焦顯 微鏡來觀測細胞內鈣離子濃度的變化以及鈣離子分布的情況，以加以比較over-expression與siRNA 的ZFHX3細胞有無明顯之差異。在第二年的實驗中，我們將利用real-time PCR與西方墨點法比較 over-expression與siRNA 的ZFHX3細胞之鈣離子調控蛋白(SERCA2a, ryanodine receptor blocker, sodium/calcium exchanger, calmoduline kinase, phospholamban, phosphorylated phospholamben) 各種 離子流之蛋白質表現量。為確認ZFHX3是否直接調控SERCA2的表現的試驗中，我們將利用染色質 免疫沉澱(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)與ChIP-seq的技術，將HL-1細胞內可能會受ZFHX3 所直接調控的基因選殖出來並加以分析，已確定ZFHX3下游受影響的基因，並利用over-expression 與RNAi的方式將這些可能受ZFHX3調控的基因加以反向調控，配合細胞箝定實驗來測量動作電位 與離子流的變化，以釐清可能參與受ZFHX3調控而引起的心房顫動之蛋白。第三年的實驗中，我 們將分離出ZFHX3 over-expression與siRNA的HL-1細胞中的miRNA，並使用miRNA array來分析可 能受影響之miRNA，配合real-time PCR定量的方式，偵測目前已知可能與心房顫動相關miRNA (miRNA-150、155、21、133、30、328、29、1、26、590等)的表現量差異。利用血管擴張素II (50 nM)、 tumor necrosis factor-α (50 ng/ml)與過氧化氫(200 M) 處理over-expression與siRNA的HL-1細胞，配 合real-time PCR定量的方式，偵測與危險因子引起心房顫動相關miRNA的表現量差異，以及使用 ZFHX3相關蛋白之變化以及是否影響其動作電位與各種離子流之相關性，並藉由高密度訊號分析， 偵測其電生理傳導之差異。