Pitx2c的調控機轉於心衰竭的心房電生理與心肌結構重塑之角色(2/2)

全基因組關聯性研究乃是研究疾病分子機轉的主要研究依據。經由全基因組相關性研究 (genome wide association study)，發現PITX2、ZFHX3與KCNN3等三個基因與心房顫動的發生有相關 性，其中4q25染色體上鄰近Pitx2c的核苷酸變異，與心房顫動的發生最具顯著關聯性。Pitx2c主要 表現在左心房與肺靜脈心肌細胞，可能具有調控心房結構與電生理功能，因此其表現之差異可能會 影響到心房顫動的發生。Pitx2c基因啟動子(promoter)有許多的CpG雙核苷酸，故可能藉由Pitx2c啟 動子的甲基化(DNA methylatoin)來調控Pitx2c的表現。在我們過去的研究成果顯示心衰竭可增加 DNA methylation，由於心衰竭常合併增加心房顫動的發生，因此，心衰竭是否可透由增加Pitx2c的 啟動子甲基化以減少Pitx2c的表現，進而改變心臟電生理特性仍有待釐清。藉由心衰竭動物模式研 究，我們的確已發現心衰竭可減少心房Pitx2c之表現並增加Pitx2c promoter methylation。然而心衰 竭造成methylation增加的機轉並不清楚，Angiotensin II、氧化壓力或發炎與心衰竭或心房顫動有 關，因此可能是導致心衰竭甲基化增加的原因。異常的鈣離子調控可造成心房顫動以及心衰竭，而 microRNA (miRNA)具有調控電生理與鈣離子的功能，藉著改變Pitx2c之表現是否會影響心房電生理 以及miRNA之表現則未有清楚研究。再則，瞭解是否可藉著調控Pitx2c之表現以改變心衰竭或心房 顫動產生之結構或電生理異常殊為重要。因此本研究旨在探討Pitx2c對心衰竭心房電生理與心肌結 構重塑之機轉，以釐清Pitx2c在心房顫動或心衰竭所扮演的角色。在第一年的實驗中，將探討心衰 竭是否會造成Pitx2c啟動子的甲基化以減少Pitx2c表現，進而增加心房顫動的危險性。亦將探討 angiotensin II與氧化壓力等機轉是否參與Pitx2c的調控。在第二年的實驗中，將探討Pitx2c基因對於 心房電生理與鈣離子調控。在第三年的實驗中，將探討是否高度表現 Pitx2c可以影響miRNA的表 現以及能否減少心衰竭產生之心房結構與電生理重塑。實驗方法：第一年的實驗，我們將藉由比較 正常與isoproterenol引發大鼠心衰竭模式，以bisulfite pyrosequencing、real-time PCR及西方墨點法方 式分別偵測左心房Pitx2c基因甲基化程度以及Kir2.1、Nav1.5、AT1R、氧化壓力相關基因的RNA及 蛋白質表現量或於HL-1細胞接受angiotensin II (1 ❍M)、tumor necrosis factor-α (50 ng/ml)與H2O2 (200 ❍M) 24小時，同時有無合併甲基化抑制劑 (DAC， 0.1 ❍M)之不同實驗組的差異。在第二年的實驗 中，利用全細胞箝定、共軛焦顯微鏡測量增加Pitx2c表現或使用siRNA轉殖細胞株減少Pitx2c表現以 及對照組的HL-1細胞動作電位(Action potential)、各種離子流的變化以及鈣離子螢光之表現並使用 real-time PCR 與西方墨點法比較這些細胞的離子流與鈣離子調控蛋白 (SERCA2a 、 ryanodine receptor 、 sodium/calcium exchanger 、 calcium calmoduline kinase II 、 total & phosphorylated phospholamban)的表現差異。第三年的實驗中，我們將藉由使用miRNA array比較增加Pitx2c表現 (Pitx2c overexpression)以及對照組之HL-1細胞，配合real-time PCR定量的方式，偵測目前已知可能 與心房顫動或心衰竭相關miRNA的表現量差異。我們亦將於HL-1細胞藉由細胞箝定與鈣離子螢光 染色探討Pitx2c是否可減少快速電刺激(10 Hz，6小時)誘導的電生理改變。此外，藉由開胸手術， 直接於心衰竭鼠左心房注射empty plasmid 或Pitx2c encoding plasmid，並於DNA注射後第7天與14 天取出心臟進行組織切片染色、傳統玻璃微電極、高密度訊號分析與西方墨點法，以偵測其心肌纖 維化、電生理學、電生理傳導以及比較這些細胞的鈣離子調控蛋白表現之差異。 初步成果：相較於控制組，心衰竭鼠左心房的 Pitx2c DNA 甲基化與 DNA methyltransferase 1 蛋白 質表現量增加，且 Pitx2c 蛋白質量減少。於增加 Pitx2c 表現之 HL-1 細胞中， Kir2.1 蛋白質表現 量顯著增加。