微型核糖核酸(microRNAs)在骨母細胞的差異表現以及在調控細胞存活和代謝上可能扮演的角色研究

骨頭結構(bone structure)的完整性，主要經由骨頭重整(bone remodeling)作用予以保持。骨母細胞 (osteoblasts)在骨頭生成過程中扮演重要角色，而不同區域(local)和系統(systemic)因子皆會調控骨母細 胞活性。然而，細胞存活(survival)和代謝(metabolism)是決定骨母細胞功能完整性的兩個重要因子。於 本實驗室先前對骨母細胞所做的系列研究中已證實(NSC90-2314-B-002-196, NSC91-2314-B-038-031, NSC92-2314-B-038-010, NSC94-2314-B-038-013)，氧化壓力(oxidative stress)會引起骨母細胞的凋亡 (apoptosis)，而作用的分子機轉亦陸續在我們的研究中被闡明(Chen et al, 2002, Chen et al., 2005a, 2005b, and Ho et al., 2005)。在最近的研究中更進一步發現(NSC95-2314-B-038-029-MY3)，若前處理低濃度一 氧化氮(nitric oxide；NO)可以保護骨母細胞免於氧化壓力所造成的傷害，而保護機轉則和誘導存活基 因Bcl-2 和Bcl-XL 的表現，以及增加Bcl-2 和Bcl-XL 蛋白由細胞質轉位(translocate)到粒線體膜的量有 關(Chang et al., 2006; Tai et al., 2007)。近來，本實驗室進行轉錄分析(transcriptional analysis)證實，轉錄 因子Runx2 和GATA-3 可能牽涉到調控Bcl-2 和Bcl-XL 的基因表現(Chang et al., 2008; Ho et al., 2008)。 除了傳統的轉錄調控(transcriptional regulation)外，最近的研究顯示細胞會生成長度約為22 nucleotides 的小分子量RNA，稱為microRNAs (miRNAs)，其能夠透過調控特定基因的轉譯作用(translation)，進 而影響細胞的功能。現在已有約500 種的miRNAs 被發現，負責調控人類約1/3 基因的表現。已有研 究證實，特定的miRNAs 在細胞遭受氧化壓力的刺激下，會有差異性的表現(differential expression)， 而這些miRNAs 則可透過調控特定基因mRNA 的轉譯(translation)作用，進而調控戲胞的存活(survival) 或死亡(death)。而在我們的先期實驗中亦顯示，氧化壓力會誘導骨母細胞生成miR-210。在骨母細胞 代謝(osteoblast metabolism)過程中，有許多bone marker genes 參與調控細胞的礦物化。miRNAs 有可能 經由調控這些bone marker genes 的表現，進而參與骨母細胞的代謝。然而，有關miRNAs 在骨母細胞 存活和代謝中可能扮演的角色，至今尚未被探討。研究骨母細胞存活和代謝的機制事關骨質的形成， 將有助於瞭解骨科常見病症如骨質疏鬆症和風濕性關節炎可能的成因。 本計劃是3 年期連續型研究計劃，將以初代培養(primary culture)大鼠頭蓋骨骨母細胞和人類骨癌 細胞株(human osteosarcoma MG63 cell line)為研究模式，探討miRNAs 在調控骨母細胞存活與代謝中可 能扮演的角色。此計劃的研究假說為：miRNAs 會參與調控骨母細胞的存活與代謝作用，而其可能發 生的分子機轉則是經由與mRNA 的3’-untraslated regions (3’-UTR)上互補位置(complementary elements)的鍵結，進而抑制特定apoptosis-related 和bone marker 基因的轉譯作用。為驗證此一研究 假說，而設定的各年次研究假說(sub-hypothesis)和目標(aims)，分別敘述如下： 計劃第一年： 研究假說：在骨母細胞的存活和代謝過程中，miRNAs 會調控特定apoptosis-related 和bone marker 基 因的表現。 研究目標：1. 首先將透過miRNAmicroarray 的分析，以測定miRNA在骨母細胞經oxidative stress (death agent)、low NO pretreatment (survival agent)和dexamethasone (differentiated agent)處理 後，可能發生的差異表現(differential expression)。 2 2. 再以cDNAmicroarray 分析方法，測定apoptosis-related 和bone marker genes 在骨母細胞 經oxidative stress (death agent)、low NO pretreatment (survival agent)和dexamethasone (differentiated agent)處理後，可能發生的差異表現(differential expression)。 3. 以real-time PCR 方法確認miRNAs 和apoptosis-related 及bone marker genes 在骨母細胞 存活與代謝過程的差異表現。 4. 最後以生物資訊法(bioinformatic approaches)研究miRNAs 和apoptosis-related 及bone marker genes 在骨母細胞發生差異表現的相互關聯性。 計劃第二年： 研究假說：miRNAs 會經由與mRNA 3’-UTR 上的complementary elements 產生鍵結，進而抑制特定 apoptosis-related 和bone marker 基因的轉譯表現(translation)。 研究目標：1. 經由miRNA inhibition 方法，探討miRNAs 抑制特定apoptosis-related 及bone marker 基 因轉譯表現，可能具有的專一性(specificity)。過程包括： a. 設計和合成特定miRNA 的wild-type 和mutant antisense oligonucleotides。 b. 將這些oligonucleotides 轉染(transfect)到骨母細胞以抑制特定miRNA 的表現。 c. 之後測定有那些apoptosis-related 及bone marker 蛋白的表現發生改變，以釐清miRNA 調控特定mRNA 轉譯表現的專一性。 2. 決定miRNAs 對特定mRNA 3’-UTR 的結合能力(binding affinity)。過程包括： a. 選定mRNA 3’-UTR 上的miRNA-binding elements，並建構此miRNA-binding elements 的wild-type 和mutant elements。 b. 將這些miRNA-binding elements 轉殖(cloning)到reporter plasmids。 c. 將reporter plasmids 轉染(transfect)到骨母細胞並測量luciferase activity。 計劃第三年： 研究假說：miRNAs 會經由抑制特定apoptosis-related 及bone marker 基因的轉譯表現，進而調控骨 母細胞的存活和代謝。 研究目標：1. 使用miRNA inhibition 方法探討，特定miRNA 是否會透過抑制專一的apoptosis-related 基因的轉譯表現，以調控細胞的存活作用。 2. 以von Kossa and Alizarin red staining 方法，探究不同的differentiated agents 和survival agents 對骨母細胞代謝作用的影響。 3. 使用miRNA inhibition 方法探討，特定miRNA 是否抑制專一的bone marker 基因的轉譯 表現。 4. 以RNA interference 技術knock-down 特定的bone marker 基因表現，並觀察骨母細胞的 礦物化，以闡明miRNA、bone marker mRNA translation 和細胞代謝間的關連性。 經由本計畫之執行，並結合本實驗室先前的研究成果，將對miRNAs 於骨母細胞中的差異表現， 以及其於骨母細胞存活與代謝作用中的角色，有更深入的瞭解。並希望經由此計劃的執行有助於骨科 相關病症成因的瞭解，並對於治療提供另一思考方向。