以尼古丁乙醯膽鹼受體拮抗劑發展乳癌細胞賀癌平(Herceptin)抗藥性之對策研究與新穎藥物開發(3/3)

計晝申請人過去研究(/ Natl Cancer Inst.2010, 102, 1322-1335)證實國人(n=276)乳癌組織 中尼古丁受體(a9-nAChR)表現量極高(Tumor/Normal >8倍），且多出現在晚期(stages III-IV)與HER-2表現的病人組織中。我們近期利用Immuno-Precipitation (IP)， Forster resonance energy transfer(FRET)與 Split luciferase 在活細胞與動物内皆證實 a9-nAChR/HER-2複合體可在乳癌細胞内形成，且此複合體形成與Herceptin抗藥性能 力有關。我們認為探討a9-nAChR/HER-2複合體形成，有助於了解乳癌病人對Herceptin 抗藥性能力產生的分子機制。在本計晝中我們期望發展a9-nAChR拮抗劑、小分子藥物 或專一^性抗體提供抑制Herceptin抗藥能力突破性的乳癌治療策略。預計於五年内完成 多項目標如下： 目標一：HER2/a9-nAChR複合體形成與乳癌抗藥性探討 為釐清a9-nAChR/HER-2複合體形成對Herceptin抗藥性之作用，我們將：1.以20餘種 乳癌細胞株探討a9-nAChR與乳癌細胞侵犯性之相關性，並已與Dr.R.Nahta (MD Anderson Cancer Center)合作建立Herceptin抗藥性細胞株。2.以FRET與FLIM在活細 胞狀態中觀察尼古丁對複合體結合的影響。3.以Split luciferase在活體腫瘤模式利用 IVIS Imaging System觀察複合體結合。4.目前已與交通大學生物資訊與系統生物研究所 所長楊進木教授合作利用電腦模擬複合體結合位點分析做為小分子標靶藥物設計。 目標二: a9-nAChR點突變影響乳癌惡性度探討 自然期刊(Nature)研究結果顯示在乳癌轉移時帶有高比例a9-nAChR突變，此結果證實我 們過去在乳癌與a9-nAChR的研究成果。我們將1.利用iPLEX與2. LCM技術分析臨床 乳癌a9-nAChR特定位點突變與乳癌細胞轉移能力及病理結果(例如HER2表現與否)分 析。3.目前與華大公司(BGI)張耕耘教授合作利用單細胞序列分析（One Cell Sequencing) 技術觀察乳癌轉移細胞或是血液細胞是否帶有a9-nAChR突變以推估癌病變情況。 目標三：a9-nAChR磷酸化位置與乳癌抗藥性能力探討 1.已發現a9-nAChR蛋白中潛藏的磷酸化位置(Y421、Y430)，將經由細胞實驗與分子技 術探討磷酸化可否受到上游(尼古丁與NNK)的調控繼而調控下游(AKT與ERK)訊息傳 遞的活化。2.經由此模式將探討a9-nAChR磷酸化位置在a9-nAChR/HER-2複合體模式 中所扮演的角色。3.觀察肺癌中a7-nAChR是否具有相似於a9-nAChR磷酸化位置。 目標四：a9-nAChR影響乳癌幹細胞形成機制與功能調控 1.流式細胞儀測定侧群細胞(Side population)或CD44+/CD24-表現的乳癌幹細胞分析系 統建立。2.分析a9-nAChR表現與乳癌幹細胞形成相關性。3. a9-nAChR小分子拮抗劑 或抗體對Herceptin抗藥性細胞株乳癌幹細胞的影響。4.利用iPS技術模擬乳癌幹細胞狀 態觀察a9-nAChR表現與乳癌幹細胞形成與乳癌抗藥性能力探討。 目標五：細胞與腫瘤模式探討a9-nAChR基因表現與乳癌抗藥性分子機制研究 1.利用小分子蛋白質藥物(RgIA)與專一性抗體觀察a9-nAChR表現對Herceptin藥物之 協同作用。2.以Herceptin抗藥性細胞觀察藥物與抗體如何影響細胞生長與 a9-nAChR/HER-2複合體形成。3.以活體腫瘤模式評估長期藥物與抗體治療對Herceptin 抗藥性能力影響、a9-nAChR/HER-2複合體形成與療效評估。4.完成臨床前動物毒性測 試，例如動物急毒性試驗。 目標六：a9-nAChR對生物發展影響 過去的研究發現a9-nAChR扮演著聽力、血球貼附與致癌基因的多樣性角色。1.我們將 利用正常與基因擊入(gene knock-in)模式在橫向（器官)與縱向(發育）空間下觀察小鼠各器 官在不同階段的病理變化。2.利用數據挖掘(Data Mining)方式和BGI公司建構不同人種 中各器官a9-nAChR蛋白的變化情況，我們期望能描繪出a9-nAChR對生物發展影響以 利未來新穎藥物之開發及其應用。