建立質譜定量分析策略以應用於癌症特定突變蛋白質之腫瘤蛋白質基因體學研究（第二至三年）(2/2)

隨著高通量及系統性基因體定序技術的發展，我們已能全面鑑定可能會致癌之體細胞突變基因。 然而，從基因到表達出蛋白質是經由嚴密的轉錄及轉譯調控，文獻曾提出許多mRNA 會被無意義介導 降解或轉譯以至於無法產生穩定且具有功能的蛋白質，從突變基因所製造出的突變蛋白質表現量仍未 被詳細探討。以質譜為基礎的蛋白體技術是準確鑑定胜肽及蛋白質的主要工具，透過整合蛋白體與具 有突變之癌症基因體，意即進行腫瘤蛋白質基因體學之研究，將有助於確認基因轉譯並鑑定專一於癌 症之突變蛋白質。為了達到此目標，我們專注於開發以質譜為主之定性與定量策略，並將其應用於癌 症專一突變之腫瘤蛋白質基因體學研究。為了建立並印證新技術，我們以非小細胞肺癌與現今臨床使 用之標靶治療標的EGFR 激酶區域突變為研究模式。EGFR 激酶區域上的突變已知與肺腺癌病人接受 EGFR 抑制劑的治療反應相關，但到目前為止，不同的EGFR 突變所導致突變蛋白質表現量與交互作 用分子網絡的變化仍不清楚。 在此計畫的第一年(2016/08~2016/12)，我們已經完成三項基礎技術之建立，包括建立客製化突變 蛋白質序列資料庫並評估其統計效力、在我們過去收集之非小細胞肺癌組織膜蛋白體資料中確認 EGFR 蛋白質的突變狀態，以及建立EGFR 蛋白質之親和純化法等，與兩項初步測試。根據現有的研 究進展，我們規劃在未來兩年內完成五項目標：(1)進行40 種EGFR 突變蛋白序列之生物資訊分析以 預測能水解出可被偵測且為突變特有胜肽之酵素，以利液相層析串聯質譜儀偵測所有的EGFR 突變； (2) 建立可準確鑑定突變胜肽之質譜分析策略，其中包含EGFR 純化、多重酵素水解、液相層析串聯 質譜偵測，及使用不同演算邏輯之搜尋引擎來進行客製化資料庫搜尋等，此外，也使用合成之突變胜 肽建立突變胜肽圖譜庫，經由圖譜相似度比對來協助確認鑑定突變胜肽的可靠性；(3)我們將針對EGFR 原生及突變胜肽建立併行反應監測質譜分析技術，以測量其在細胞中之絕對濃度；(4)此項技術將進一 步應用於一系列帶有不同EGFR 突變之非小細胞肺癌細胞株上，測量各種突變及相對應之原生EGFR 蛋白在細胞中之含量，並且同時分析不同EGFR 突變所引發之交互作用蛋白體；(5)最後，透過整合 RNA 表現量、EGFR 突變蛋白表現量及其蛋白質交互作用差異等數據，將有助了解EGFR 突變在不同 分子層次所產生的影響及其與癌症進程、EGFR 抑制劑治療反應之相關性。我們期許此計畫所發展的 質譜分析策略將會是腫瘤蛋白質基因體學的研究利器。