細胞與分子生物機轉暨組蛋白去乙醯脢之附基因調控於手術後引發之心房與肺靜脈心律不整機轉(2/3)

背景：心房纖維顫動（atrial fibrillation, AF）是最常見的持續性心律不整之一。術後心房纖維顫動乃 是接受心臟外科手術的病患最易發生之心律過速不整脈 (tachyarrythmias)，不但增加了手術後併發症 也顯著增加了手術之早期或晚期死亡率。然而，對於術後心房纖維顫動的病理生理機轉目前並未清 楚明瞭且對於術後心房纖維顫動的治療效果依然不佳。左心房肌 (Left atrium) 和肺靜脈心肌組織 (pulmonary vein) 是誘發心房纖維顫動非常重要的基質(substrate)和觸發器(trigger)。心房纖維顫動常 出現肺靜脈心肌組織或心房肌高心律不整活性以及出現電氣生理重塑有關。除此之外，竇房結 （sinoatrial node）之功能失調對於心房纖維顫動之病理生理學扮演著極重要的角色。細胞內鈣離子濃 度超載(calcium overload)或細胞內鈣離子濃度側漏(calcium leak)所引起的細胞內不正常的鈣離子濃度 調控，可提高細胞之觸發性活性而誘發心房纖維顫動的發生。肺靜脈心肌組織和左心房肌有較多的 細胞內鈣離子濃度恆定失調及觸發性活性。因此，手術後可能造成細胞鈣離子濃度恆定失控，而引 起心房纖維顫動之發生。組織蛋白去乙醯酶 (histone deacetylases, HDACs)是一種附基因(Epigenetic) 調控，對於心血管疾病再塑造過程之基因表現扮演著極為關鍵的角色。從動物實驗模型中已知，心 房纖維顫動與組織蛋白去乙醯酶的活性增加有相當關聯性，且組織蛋白去乙醯酶抑制劑可減少心房 纖維顫動的發生。此外，抑制組織蛋白去乙醯酶可調控細胞內鈣離子濃度恆定藉以減少肺靜脈心肌 之心律不整活性與心房纖維顫動的發生。組織蛋白去乙醯酶包含多種類別，而且不同的組織蛋白去 乙醯酶抑制劑可能具有不同調控心肌細胞鈣離子恆定和電生理活性。因此本研究的目的旨在建立手 術後心房纖維顫動之動物疾病模式並研究調控離子流對於手術後心房纖維顫動之影響及其細胞與分 子生物機轉。在第一年的研究中，我們將評估手術後心律不整機轉及肺靜脈心肌、竇房結、左右心 房肌之組織蛋白去乙醯酶活性的改變及組織病理學的特性，並且研究各種不同的組織蛋白去乙醯酶 抑制對於肺靜脈心肌、竇房結、左右心房肌於手術後之電生理特性及細胞傳導特性之影響。在第二 年的研究中，我們將探討手術後肺靜脈心肌、竇房結、左右心房肌之各種離子流及通道結構的分子 變化，來解析手術後心房纖維顫動之觸發器和基質之心律不整機轉。在第三年的研究中，我們將透 過測量細胞內鈣離子濃度實驗、分子生物實驗、單一通道離子流記錄來評估手術後肺靜脈心肌、竇 房結、左右心房肌之細胞內鈣離子濃度恆定的變化與不同的組織蛋白去乙醯酶抑制之差異性。 方法：在第一年的實驗中，對於控制組、手術後組(內心包膜切開組)的兔子以及手術後組加入不同組 織蛋白去乙醯酶抑制劑(手術後連續給予七天具多型HDAC 抑制之MPT0E014、具HDAC1 及 3 抑 制之MS-275、或具HDAC4 及6 抑制之MC-1568 各10mg/kg) 研究其組間之生物化學、心電圖和心 臟超音波的差異性。藉傳統微電極技術、微電極陣列分析、和組織學檢查被用於測量分析其兔子肺 靜脈心肌組織、竇房結、左右心房肌之組織標本的差異性。對於控制組、手術後組以及手術後組加 入組織蛋白去乙醯酶抑制劑的兔子體內的心房電性活性及誘發心房纖維顫動 (利用快速心房刺激和 乙醯膽鹼灌注而誘發心房纖維顫動），使用心電圖及心內電圖來進行測量其差異性，及利用西方點墨 法來研究其組織蛋白去乙醯酶蛋白質的表達量差異及測量組織蛋白去乙醯酶活性。在第二年的實驗 中，利用西方點墨法來研究通道蛋白質和連接蛋白質(connexin)的表達量，以及全細胞膜箝定技術被 用來研究從控制組、手術後組兔子以及手術後組加入組織蛋白去乙醯酶抑制劑共三組中分離出單一 肺靜脈心肌組織、竇房結、左右心房肌心肌細胞的各離子電流 (例如:鈉、鉀、鈣離子電流…等)。在 第三年的實驗中，我們將利用共軛焦顯微鏡螢光技術來研究細胞內鈣離子濃度的恆定、細胞內鈣離 子濃度側漏、和細胞內鈣離子濃度亮點，以及使用單一通道記錄技術來評估從控制組、手術後組兔 子以及手術後組加入組織蛋白去乙醯酶抑制劑共三組中分離出單一肺靜脈心肌組織、竇房結、左右 心房肌心肌細胞的肌漿網(SERCA2a)的活性和蘭尼鹼受體通道打開的概率。並且利用西方點墨法來 研究關於細胞內鈣離子濃度調控之蛋白質的表達量。 初步的結果：我們發現，手術後兔子有比較高心房過速性心律不整的發生率，以及增快肺靜脈心肌 組織自發性節律和提高觸發性活性的發生。這些結果顯示，手術後的肺靜脈心肌組織具有比較高心 律不整的機轉，這可能導致它們有比較高的心房纖維顫動發生率。