Aldose reductase (AR)調控膠原蛋白GPVI及凝血?PAR4所引起血小板活化及細胞凋亡的新角色: Arf-AR在無核細胞中所扮演的訊息傳遞機制 (II)(2/2)

Aldose reductase (AR)是一種NADPH-依賴型的酵素，它可將glucose還原成sorbitol,同時伴隨 著氧化壓力的增加。Sorbitol因無法穿過細胞膜，因此會堆積在細胞内而導致離子的不平衡及蛋 白質溶解度下降，許多研究已證實高血糖症所引起的一些併發症可能與此反應有關。最近更有研 究指出，在正常的血糖濃度下，AR也參與細胞增生及細胞凋亡反應，同時它亦與動脈血栓的形 成有關。血小板為無核細胞，其生理功能為參與體内凝血反應或者誘發病理性的動脈血栓。 Collagen及thrombin都是重要的血小板活化劑，collagen會結合到其受體如glycoprotein (GP)VI 及 integrin a2p1, thrombin 也會結合到其受體 protease-activated receptors (PARs;如 PAR1 及 PAR4)， 這些結合會分別引起不同的訊息傳遞作用而刺激血小板活化。再者像Ras superfamily的這些小分 子GTPase如ADP-ribosylation factors (Arfs)亦與血小板活化有關，其中Arf6為Arf家族中唯一結 合到細胞膜的GTPase，目前Arf6被認為有可能參與初期的血小板活化反應。另外，因血小板是 由megakaryocyte所分裂而來的，因此megakaryocyte可能會賦予血小板一定量且具蛋白轉譯功能 的mRNA ；未活化的血小板其既存的mRNA具一定限度的蛋白轉譯能力，一旦它被活化則其轉 譯能力亦隨之增加。最近有研究指出血小板具有功能性的spliceosomal components,其功能應與 pre-mRNA splicing成mRNA有關，至於其轉譯機制目前仍不明。一般細胞凋亡反應約可分為 caspase-dependent 及-independent 二個路徑；caspase-dependent 路徑主要經由外部的 death receptor (DR)被活化或經由粒線體的反應，而caspase-independent路徑主要與apoptogenic factors對細胞核 的作用有關。目前已知血小板亦會表現一些與細胞凋亡有關的蛋白如caspases等，但這些蛋白如 何在無核細胞中進行細胞凋亡反應同時其與臨床疾病間的相關聯性等目前研究亦不多。在第一年 的研究計晝中，我們發現投與AR的專一性抑制劑epalrestat可明顯的抑制由collagen及convulxin (GPVI的活化劑)所引起的血小板凝集反應，但對aggretin (integrin a201活化劑)則無抑制作用；同 時epalrestat亦可明顯的抑制由thrombin及PAR4-AP所引起的凝集反應，但對PAR1-AP則無抑制 作用，此結果顯示AR可能參與collagen受體GPVI及thrombin受體PAR4所引起的血小板活化 反應。再者，convulxin及PAR4-AP可增加AR蛋白的表現且此反應可被epalrestat, cycloheximide 或者轉染之AR siRNA所抑制。利用RT-PCR及新世代定序儀(NGS)實驗，也證實血小板的確有 AR mRNA的存在。另外，利用LC-MS/MS及飛行時間式二次離子質譜儀(TOP-SIMS)分析，結果 也顯示convulxin的確可增加sorbitol的產生。由上述結果顯示，GPVI及PAR4的確可調控AR的 活性及其蛋白表現，且此蛋白表現會被mRNA所調控。另外，我們亦發現convulxin會活化Arf6， 但此反應無法被epalrestat所抑制，推測Arf6可能是AR的上游調控者，但Arf6-AR之間如何運 作亦或兩者間需經由第三者來傳遞訊息，值得進一步闡明。另外，convulxin也會刺激caspase 3 的活化，且此反應可被epalrestat所抑制，此暗示著AR亦可能參與血小板細胞凋亡反應。綜合以 上結果顯示AR不論在血小板活化或細胞凋亡過程中的確扮演重要角色，但對於其詳細作用機轉 特別是在無核細胞中其mRNA如何透過轉譯機制(translational machinery)增加AR蛋白的表現目前 仍不清楚也是值得研究的課題。因此本二年研究計晝將繼續深入且有系統性的研究AR對血小板 的影響。 目標1:比較在正常血糖濃度下，AR對GPVI及PAR4所調控的血小板訊息傳遞作用的差異性。 目標2:研究及比較AR與上游調控者(如Arf family或一些未知蛋白）分別與GPVI及PAR4間的 相互作用關係。 目標3:探討GPVI及PAR4分別被刺激下，無細胞核的血小板mRNA是透過何種轉譯機制來調 控AR蛋白的表現。 目標4:利用AR基因剔除鼠的血小板，探討AR分別在GPVI及PAR4所誘發的血小板活化及細 胞凋亡反應中其所扮演的角色及其相關訊息傳遞作用。 透過本計劃的完成將使我們更清楚的了解AR在血小板活化過程中所扮演的角色，同時也提供新 的治療方向以防止體内動脈血栓的形成。