膠原蛋白受體glycoprotein VI所調控的血小板細胞自噬作用中aldose reductase和NF-kB的訊息傳遞作用:內生性GABA在此無核細胞中的調節作用

細胞自噬是細胞自我吞噬的一個過程，大約可分成幾個步驟:誘發作用、胞噬體(autophagosome)的形成、 自溶酶體(autolysosome)的形成以及細胞內負載物的分解及循環再利用；其中胞噬體在細胞自噬過程中扮 演重要角色。另外microtubule-associated protein 1 light chain 3 (LC3)在形成自溶酶體的過程中扮演關鍵性 的角色，LC3 會在胞噬體膜上被切成LC3I 及LC3II，因此LC3II 也被視為細胞自噬過程中的重要活性指 標。最近對一些發生在細胞內特定胞器的自噬作用也愈發受到重視如mitophagy。細胞自噬的主要目的 之一是要移除細胞內已凝集(aggregated)或失去活性的蛋白質以維持細胞品質，此外在飢餓狀態下細胞也 會經由自噬作用將脂肪及肝醣分別分解成脂肪酸及葡萄糖藉以產生能量維持細胞的活性。血小板為無核 細胞其生理功能為參與凝血反應或者誘發動脈血栓。Collagen 主要位於血管內皮下層為重要的血小板活 化劑，它會結合到glycoprotein (GP) VI 及integrin 21 而引起不同的訊息傳遞作用進而刺激血小板活化。 另外，-aminobutyric acid (GABA)是CNS 最主要的抑制性神經傳導物。我們最近研究發現血小板內含高 濃度的GABA 其作用為GP VI 的抑制劑；因此GABA 可能是體內防止動脈栓塞的重要物質。Aldose reductase (AR)是一種NADPH-依賴型的酵素，它可將glucose 還原成sorbitol，同時伴隨著氧化壓力的增 加。在去年的科技部計畫中我們發現transfected AR siRNA 可明顯的抑制由convulxin (GP VI 活化劑)所 引起的血小板凝集反應，但對aggretin (integrin 2活化劑)所引起的凝集反應則不具抑制活性。由飛行 時間式二次離子質譜儀(TOF-SIMS)分析顯示convulxin 會明顯增加AR 蛋白表現及sorbitol 的量。在新世 代定序(NGS)實驗中也證實血小板的確含有AR mRNA 的存在。綜合這些結果顯示GP VI 確實可調控AR 的活性及其蛋白表現，且此蛋白表現應該會被其mRNA 所調控。最近我們也發現NF-B 亦存在於無核 的血小板中，NF-B 可從細胞質進入粒線體中並結合至其DNA (mtDNA)，至於其作用則不明。此結果 暗示著NF-B 可能在一般所認知的轉錄調控作用之外，存有另一種全新的非基因性調控作用來控制無核 細胞的訊息傳遞作用，但此假設仍待進一步證明。另外我們亦發現GABA 或epalrestat (AR 抑制劑)能明 顯抑制convulxin 所引起的IKKβ 的磷酸化，但andrographolide (NF-B 抑制劑)則無法抑制由convulxin 所引起的AR 蛋白表現及sorbitol 量的增加；此結果暗示著AR 可能是NF-B 的上游調控者。因此血小 板可說是研究NF-B 在無核細胞中非基因性調控作用的最佳標的細胞。如前述細胞自噬在有核細胞中扮 演重要角色，但對無核細胞如血小板目前研究不多所知亦有限。最近有研究指出當血小板活化時可能會 伴隨著自噬作用的發生，我們初步研究亦顯示convulxin 會增加血小板LC3II/LC3I 的比值及降低p62 的 去磷酸化，但aggretin 並不會引起這些反應，而且GABA, epalrestat 或andrographolide 會明顯抑制convulxin 所引起的此兩種反應；在去迴旋積(deconvolution)顯微鏡中也觀察到血小板有類似細胞自噬的胞器存在。 因此我們認為血小板可經由GP VI 而活化AR/NF-B 進而引起細胞自噬作用；同時內生性GABA 可抑 制此反應，至於GABA 的詳細作用機轉以及NF-κB 在GP VI-依賴型的自噬作用中所扮演的非基因性作 用至今仍不清楚，因此本三年計畫將首次有系統性地探討這些問題。 具體目標1：研究GP VI 受體所調控的血小板細胞自噬作用以及GABA 的可能抑制作用機轉。 具體目標2：利用人類或Atg5 基因剔除老鼠(Atg5-/- mice)的血小板，探討自噬作用發生時的能量代謝變 化以及與血栓或凝血反應的可能相關性。 具體目標3：探討血小板的NF-B 如何調控mtDNA 以及與細胞自噬作用的關係性。 具體目標4：利用人類或Ar 基因剔除老鼠(Ar-/- mice)，經由不同的體外或動物實驗去探討GP VI-AR 的 相關訊息傳遞作用在血小板自噬作用過程中所扮演的角色。 具體目標5：利用人類或NF-B 基因剔除老鼠(NF-B-/- mice)的血小板，探討AR-NF-B 及其下游路徑 對調控血小板自噬作用的可能機制。 透過本計劃的完成將可進一步了解血小板的活化與細胞自噬作用間的關係；同時可藉由標定某些特 殊的血小板細胞自噬作用機制，發展出新的細胞自噬抑制劑來降低血小板活化進而做為臨床上治療動脈 血栓的另一新的選擇與策略。